背景技术：
1、编码用于治疗应用的生理上重要的蛋白质的信使rna(mrna)，与基于dna的质粒和病毒载体相比，在递送遗传物质方面显示出显著优势。然而，基于mrna的疗法可能存在潜在缺点，例如脱靶刺激先天性免疫响应，这可能会干扰治疗功效。
2、因此，业界需要改进的mrna疗法和生产方法。
技术实现思路
1、本文提供了用于递送包含单链rna(ssrna)载体的自扩增表达系统的组合物，其中所述ssrna载体包含7-甲基鸟苷酸(m7g帽)、聚腺苷酸化(聚a)尾、自扩增骨架以及一种或多种经修饰核苷，其中所述一种或多种经修饰核苷包括m5c并且不包括其他经修饰核苷酸，任选地除了m7g帽类似物之外。
2、本文还提供了用于递送包含单链rna(ssrna)载体的自扩增表达系统的组合物，其中所述ssrna载体包括7-甲基鸟苷酸(m7g帽)、聚腺苷酸化(聚a)尾、自扩增骨架和一种或多种经修饰核苷。
3、在一些方面，自扩增骨架包括选自自复制rna病毒的多核苷酸。在一些方面，自复制rna病毒选自包括甲病毒、黄病毒、麻疹病毒和弹状病毒的组。
4、在一些方面，一种或多种经修饰核苷包括甲基-5-胞嘧啶(m5c)、甲基-6-腺苷(m6a)、核糖-甲基化(2'-o-me)、s-硫尿苷(s2u)、5-甲基尿苷(m5u)、n1-甲基假尿苷(m1ψ)、假尿苷(ψ)或其任何组合。在一些方面，一种或多种经修饰核苷包括m5c。在一些方面，一种或多种经修饰核苷包括m5c并且不包括其他经修饰核苷酸，任选地除了m7g帽类似物之外。
5、在一些方面，ssrna载体是纯化的。在一些方面，ssrna载体通过色谱来纯化。在一些方面，色谱包括纤维素色谱系统或基于亲和力的分离系统。在一些方面，基于亲和力的分离系统是脱氧胸苷(dt)寡核苷酸(oligo(dt))系统。
6、在一些方面，ssrna载体的大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞苷和/或尿苷核苷是经修饰核苷。在一些方面，ssrna载体的大于25％的腺苷、鸟苷、胞苷和/或尿苷核苷包含经修饰核苷。在一些方面，ssrna载体的100％的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞苷和/或尿苷核苷包含经修饰核苷。在一些方面，ssrna载体包含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的胞苷核苷包含经修饰核苷。在一些方面，ssrna载体中大于25％的胞苷核苷包含经修饰核苷。在一些方面，ssrna包含100％的胞苷核苷是经修饰核苷。
7、在一些方面，组合物包含小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、小于0.5％、或小于0.1％的污染物。在一些方面，污染物包括盐、洗涤剂和/或双链rna(dsrna)。在一些方面，污染物包括dsrna。
8、在一些方面，ssrna载体占组合物中存在的总rna的70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、或95％或更多。在一些方面，ssrna载体占组合物中存在的总rna的97％或更多、98％或更多、99％或更多、或99.5％或更多。在一些方面，ssrna载体是组合物中存在的唯一rna种类。在一些方面，总rna、dsrna和/或ssrna含量通过斑点印迹或elisa来评估，任选地其中斑点印迹或elisa评估包括用对rna、dsrna和/或ssrna具有特异性的抗体进行检测。在一些方面，总rna、dsrna和/或ssrna含量通过毛细管电泳来评估。在一些方面，总rna、dsrna和/或ssrna含量通过液相色谱来评估。在一些方面，rna、dsrna和/或ssrna含量被量化为曲线下面积(auc)。
9、在一些方面，ssrna载体通过体外转录产生。在一些方面，m7g帽包含m7g帽类似物。在一些方面，m7g帽类似物包括三核苷酸m7g-ppp-a-u帽类似物或二核苷酸m7g-ppp-a帽类似物。
10、在一些方面，ssrna载体包含盒，所述盒包含至少一种用于递送的核酸序列，任选地其中所述至少一种核酸序列包含多肽编码核酸序列，任选地其中所述多肽编码核酸序列是抗原编码核酸序列，并且其中所述盒可操作地连接至自扩增骨架或可操作地插入至自扩增骨架中。
11、在一些方面，自扩增骨架包含选自自复制rna病毒的多核苷酸，其包含至少一种由下式从5’至3’描述的核酸序列：
12、m7g-ppp-n1-n2-nv，其中
13、m7g是7-甲基鸟苷酸(m7g)帽，
14、ppp是三磷酸桥，
15、n1是所述自扩增骨架的第一核苷酸，对应于所述自复制rna病毒的第一内源性5’核苷酸，
16、n2是所述自扩增骨架的第二核苷酸，对应于所述自复制rna病毒的第二内源性5’核苷酸，并且
17、nv包含(1)所述自扩增骨架的一种或多种额外核酸序列，以及(2)包含至少一种用于递送的核酸序列的盒，任选地其中所述至少一种核酸序列包含多肽编码核酸序列，任选地其中所述多肽编码核酸序列是抗原编码核酸序列，并且其中所述盒可操作地连接至所述自扩增骨架或可操作地插入至所述自扩增骨架中。
18、在一些方面，组合物还包含纳米粒子递送媒介物。在一些方面，纳米粒子递送媒介物是脂质纳米粒子(lnp)。
19、本文还提供了药物组合物，其包含本文所述的任一种组合物和药学上可接受的载剂。
20、本文还提供了用于治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用一定量的本文所述的任一种组合物或本文所述的任一种药物组合物。在一些方面，所述疾病是癌症或感染性疾病。在一些方面，感染性疾病由选自包括以下的组的病毒引起：hpv、流感、tb、cmv、hmpv、piv、基孔肯雅病毒(chikungunya virus)、寨卡病毒(zika virus)、sars-cov-2和泛冠状病毒。
21、在一些方面，组合物中ssrna载体的量为1000μg或更少、100μg或更少、50μg或更少、30μg或更少、10μg或更少、5μg或更少、或1μg或更少。
22、在一些方面，与接受包含不含经修饰核苷的核酸序列的组合物的对照受试者相比，受试者中的先天性免疫响应降低。在一些方面，先天性免疫响应是ifn响应。在一些方面，ifn响应是irf-3表达、irf-7表达或其组合。
23、在一些方面，与包含另外相同的ssrna载体但不包含经修饰核苷的对照组合物相比，ssrna载体的复制增加。
24、本文还提供了从核酸混合物中纯化自扩增表达系统的方法，所述方法包括通过纤维素色谱系统或基于亲和力的分离系统纯化所述自扩增表达系统，其中所述自扩增表达系统包含单链rna(ssrna)载体，并且其中所述ssrna载体包含m7g帽、聚a尾和自扩增骨架。
25、本文还提供了一种减少核酸混合物中的双链rna(dsrna)的方法，所述方法包括：
26、(a)通过纤维素色谱系统或基于亲和力的分离系统纯化所述自扩增表达系统；和/或
27、(b)产生所述自扩增表达系统，使得所述自扩增表达系统包含经修饰核苷；并且
28、其中所述自扩增表达系统包含单链rna(ssrna)载体，其中所述ssrna载体包含m7g帽、聚a尾和自扩增骨架。
29、在一些方面，基于亲和力的分离系统包括脱氧胸苷(dt)寡核苷酸(oligo(dt))系统。在一些方面，ssrna载体包含经修饰核苷。在一些方面，经修饰核苷包括甲基-5-胞嘧啶(m5c)、甲基-6-腺苷(m6a)、核糖-甲基化(2'-o-me)、s-硫尿苷(s2u)、5-甲基尿苷(m5u)、n1-甲基假尿苷(m1ψ)、假尿苷(ψ)或其任何组合。在一些方面，经修饰核苷由甲基-5-胞嘧啶(m5c)组成。
30、本文还提供了一种组合物混合物，其中所述组合物包含自扩增表达系统，其包含：
31、(a)单链rna(ssrna)载体，其中所述ssrna载体包含m7g帽、聚腺苷酸化(聚a)尾和自扩增骨架；以及
32、(b)双链rna(dsrna)，并且
33、其中所述dsrna占所述混合物中存在的总rna的小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、小于0.5％或小于0.1％。
34、本文还提供了一种组合物混合物，其中所述组合物包含自扩增表达系统，其包含：
35、(a)单链rna(ssrna)载体，其中所述ssrna载体包含m7g帽、聚腺苷酸化(聚a)尾和自扩增骨架；以及
36、(b)双链rna(dsrna)，并且
37、其中所述ssrna载体占所述混合物中存在的总rna的70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或99.5％或更多。
38、在一些方面，唯一可检测的rna包含ssrna载体。在一些方面，总rna、dsrna和/或ssrna含量通过斑点印迹或elisa来评估，任选地其中斑点印迹或elisa评估包括用对rna、dsrna和/或ssrna具有特异性的抗体进行检测。在一些方面，总rna、dsrna和/或ssrna含量通过毛细管电泳来评估。在一些方面，总rna、dsrna和/或ssrna含量通过液相色谱来评估。在一些方面，rna、dsrna和/或ssrna含量被量化为曲线下面积(auc)。
39、在一些方面，ssrna通过体外转录产生。在一些方面，m7g帽包含m7g帽类似物。在一些方面，m7g帽类似物包括三核苷酸m7g-ppp-a-u帽类似物或二核苷酸m7g-ppp-a帽类似物。
40、在一些方面，ssrna载体包含盒，所述盒包含至少一种用于递送的核酸序列，任选地其中所述至少一种核酸序列包含多肽编码核酸序列，任选地其中所述多肽编码核酸序列是抗原编码核酸序列，并且其中所述盒可操作地连接至自扩增骨架或可操作地插入至自扩增骨架中。在一些方面，自扩增骨架包含选自自复制rna病毒的多核苷酸，其包含至少一种由下式从5’至3’描述的核酸序列：
41、m7g-ppp-n1-n2-nv，其中
42、m7g是7-甲基鸟苷酸(m7g)帽，
43、ppp是三磷酸桥，
44、n1是所述自扩增骨架的第一核苷酸，对应于所述自复制rna病毒的第一内源性5’核苷酸，
45、n2是所述自扩增骨架的第二核苷酸，对应于所述自复制rna病毒的第二内源性5’核苷酸，并且
46、nv包含(1)所述自扩增骨架的一种或多种额外核酸序列，以及(2)包含至少一种用于递送的核酸序列的盒，任选地其中所述至少一种核酸序列包含多肽编码核酸序列，任选地其中所述多肽编码核酸序列是抗原编码核酸序列，并且其中所述盒可操作地连接至所述自扩增骨架或可操作地插入至所述自扩增骨架中。
47、在一些方面，ssrna载体包含一种或多种经修饰核苷。在一些方面，一种或多种经修饰核苷包括甲基-5-胞嘧啶(m5c)、甲基-6-腺苷(m6a)、核糖-甲基化(2'-o-me)、s-硫尿苷(s2u)、5-甲基尿苷(m5u)、n1-甲基假尿苷(m1ψ)、假尿苷(ψ)或其任何组合。在一些方面，一种或多种经修饰核苷包括m5c。在一些方面，一种或多种经修饰核苷包括m5c并且不包括其他经修饰核苷酸，任选地除了帽类似物之外。
48、在一些方面，ssrna载体是纯化的。在一些方面，ssrna载体通过色谱来纯化。在一些方面，色谱包括纤维素色谱系统或基于亲和力的分离系统。在一些方面，基于亲和力的分离系统是脱氧胸苷(dt)寡核苷酸(oligo(dt))系统
49、在一些方面，用于递送自扩增表达系统的组合物包含：
50、(a)所述自扩增表达系统，其中所述自扩增表达系统包含一种或多种自扩增mrna(sam)载体，其中所述一种或多种sam载体包含：
51、(a)所述自扩增骨架，其中所述自扩增骨架包含以seq id no:6所示的核酸序列，其中所述自扩增骨架序列包含亚基因组启动子核苷酸序列和聚(a)序列，其中所述亚基因组启动子序列对于所述自复制rna病毒是内源的，其中所述聚(a)序列对于所述自复制rna病毒骨架是内源的；和
52、(b)整合在所述亚基因组启动子核苷酸序列与所述聚(a)序列之间的盒，其中所述盒可操作地连接至所述亚基因组启动子核苷酸序列，并且任选地其中所述盒包含至少一种抗原编码核酸序列，所述抗原编码核酸序列包含：
53、a.表位编码核酸序列，任选地包含：(1)使所编码的表位序列与由野生型核酸序列编码的相应肽序列不同的至少一种改变，或(2)编码感染性疾病生物体肽的核酸序列，所述肽选自由以下各项组成的组：病原体衍生肽、病毒衍生肽、细菌衍生肽、真菌衍生肽和寄生虫衍生肽，
54、b.任选的5’接头序列，和
55、c.任选的3’接头序列；和
56、(b)任选地，脂质纳米粒子(lnp)，其中所述lnp包封自扩增表达系统。
57、在一些方面，用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物中的所述盒的每个元件的有序序列描述于下式，从5’至3’包含：
58、pa-(l5b-nc-l3d)x-(g5e-uf)y-g3g
59、其中p包含第二启动子核苷酸序列，其中a＝0或1，
60、n包含表位编码核酸序列之一，其中所述表位编码核酸序列包含mhc i类表位编码核酸序列，其中c＝1，
61、l5包含5’接头序列，其中b＝0或1，
62、l3包含3’接头序列，其中d＝0或1，
63、g5包含编码gppgg氨基酸接头的至少一种核酸序列之一，其中e＝0或1，
64、g3包含编码gppgg氨基酸接头的至少一种核酸序列之一，其中g＝0或1，
65、u包含至少一种mhc ii类表位编码核酸序列之一，其中f＝1，
66、x＝1至400，其中对于每个x，相应的nc是mhc i类表位编码核酸序列，并且
67、y＝0、1或2，其中对于每个y，相应的uf是mhc ii类表位编码核酸序列。
68、在一些方面，对于每个x，相应的nc是不同的mhc i类表位编码核酸序列。在一些方面，对于每个y，相应的uf是不同的mhc ii类表位编码核酸序列。
69、在一些方面，a＝0，b＝1，d＝1，e＝1，g＝1，h＝1，x＝10，y＝2，所述至少一种启动子核苷酸序列是由所述自扩增骨架提供的单个亚基因组启动子核苷酸序列，所述至少一种聚腺苷酸化聚(a)序列是由所述自扩增骨架提供的至少80个连续a核苷酸的聚(a)序列，所述盒整合在所述亚基因组启动子核苷酸序列和所述聚(a)序列之间，其中所述盒可操作地连接至所述亚基因组启动子核苷酸序列和所述聚(a)序列，每个n编码长度为7-15个氨基酸的mhc i类表位，l5是编码所述mhc i表位的原生n末端氨基酸序列的原生5’接头序列，并且其中所述5’接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，l3是编码所述mhc i表位的原生c末端氨基酸序列的原生3’接头序列，并且其中所述3’接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，u是padre ii类序列和破伤风类毒素mhc ii类序列中的每一者，所述自扩增骨架是以seq id no:6所示的序列，并且所述mhc i类表位编码核酸序列中的每一者编码长度为13至25个氨基酸的多肽。
70、在一些方面，用于递送的至少一种核酸序列包含多肽编码核酸序列。在一些方面，所述多肽编码核酸序列编码抗原编码核酸序列。在一些方面，所述抗原编码核酸序列包含mhc i类表位、mhc ii类表位、能够刺激b细胞响应的表位或其组合。在一些方面，所述抗原编码核酸序列包含编码全长蛋白质、蛋白质亚基、蛋白质结构域或其组合的序列。在一些方面，所述多肽编码核酸序列编码全长蛋白质或其功能部分。在一些方面，所述全长蛋白质或其功能部分选自由以下各项组成的组：抗体、细胞因子、嵌合抗原受体(car)、t细胞受体和基因组编辑系统核酸酶。
71、在一些方面，用于递送的至少一种核酸序列包含至少一种包含非编码核酸序列的核酸序列。在一些方面，所述非编码核酸序列是rna干扰(rnai)多核苷酸或基因组编辑系统多核苷酸。
72、在一些方面，所述lnp包含选自由以下各项组成的组的脂质：可电离氨基脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇、基于peg的外壳脂质或其组合。在一些方面，所述lnp包含可电离氨基脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和基于peg的外壳脂质。在一些方面，所述可电离氨基脂质包含mc3样(二亚油醇甲基-4-二甲基氨基丁酸酯)分子。在一些方面，lnp包封的表达系统的直径在60-140nm之间。
73、在一些方面，用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物被配制用于肌内(im)、皮内(id)、皮下(sc)、玻璃体内(ivt)、鞘内或静脉内(iv)施用。在一些方面，用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物被配制用于肌内(im)施用。
74、在一些方面，所述盒整合在所述至少一种启动子核苷酸序列和所述至少一种聚(a)序列之间。在一些方面，所述至少一种启动子核苷酸序列可操作地连接至所述盒。
75、在一些方面，ssrna载体包含正链rna载体。在一些方面，ssrna载体包含负链rna载体。在一些方面，负链rna载体包含麻疹病毒或弹状病毒的至少一种多核苷酸序列。在一些方面，ssrna载体在哺乳动物细胞内自扩增。在一些方面，所述自复制rna病毒选自由以下各项组成的组：甲病毒；黄病毒、麻疹病毒和弹状病毒。在一些方面，所述自扩增骨架包含甲病毒的至少一种多核苷酸序列，任选地其中所述甲病毒选自由以下各项组成的组：奥拉病毒(aura virus)、摩根堡病毒(fort morgan virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelanequine encephalitis virus)、罗斯河病毒(ross river virus)、塞姆利基森林病毒(semiliki forest virus)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)和马雅罗病毒(mayarovirus)。在一些方面，所述自扩增骨架包含委内瑞拉马脑炎病毒的至少一种核苷酸序列。在一些方面，所述自扩增骨架至少包含由所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的核苷酸序列编码的用于非结构蛋白介导的扩增的序列、亚基因组启动子序列、聚(a)序列、非结构蛋白1(nsp1)基因、nsp2基因、nsp3基因和nsp4基因。在一些方面，所述自扩增骨架至少包含由所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的核苷酸序列编码的用于非结构蛋白介导的扩增的序列、亚基因组启动子序列和聚(a)序列。在一些方面，所述用于非结构蛋白介导的扩增的序列选自由以下各项组成的组：甲病毒5’utr、51-nt cse、24-nt cse、26s亚基因组启动子序列、19-nt cse、甲病毒3’utr或其组合。在一些方面，所述自扩增骨架不编码结构性病毒粒子蛋白衣壳e2和e1，任选地其中e1是全长e1，或不编码结构性病毒粒子蛋白衣壳e3、e2、6k。在一些方面，所述盒被插入以代替所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的多核苷酸序列内的结构性病毒粒子蛋白。在一些方面，所述委内瑞拉马脑炎病毒包含seq id no:3或seq id no:5的序列。在一些方面，所述委内瑞拉马脑炎病毒包含seq id no:3或seq id no:5的序列，其还包含碱基对7544和11175之间的缺失。在一些方面，所述自扩增骨架包含以seq id no:6或seq id no:7所示的序列。在一些方面，所述盒被插入在seq id no:6或seq id no:7中的位置7544处。在一些方面，所述盒的插入提供了包含nsp1-4基因和至少一种核酸序列的多顺反子rna的转录，其中所述nsp1-4基因和所述用于递送的至少一种核酸序列在单独的开放阅读框中。
76、在一些方面，ssrna载体包含至少一种启动子核苷酸序列。在一些方面，至少一种启动子核苷酸序列包括由自复制rna病毒编码的原生启动子核苷酸序列，任选地其中所述原生启动子核苷酸序列是亚基因组启动子核苷酸序列。在一些方面，至少一种启动子核苷酸序列是外源rna启动子。在一些方面，ssrna载体包含第二启动子序列，任选地其中第二启动子核苷酸序列是亚基因组启动子核苷酸序列。在一些方面，所述第二启动子核苷酸序列包含多个亚基因组启动子核苷酸序列，其中每个亚基因组启动子核苷酸序列提供所述单独的开放阅读框中的一者或多者的转录。
77、在一些方面，ssrna载体的大小为至少300nt。在一些方面，ssrna载体的大小为至少1kb。在一些方面，ssrna载体的大小为至少2kb。在一些方面，ssrna载体的大小为小于5kb。
78、在一些方面，至少一种抗原编码核酸序列包含两种或更多种抗原编码核酸序列。在一些方面，每种抗原编码核酸序列彼此直接连接。在一些方面，每种抗原编码核酸序列通过编码接头的核酸序列与不同的抗原编码核酸序列连接。在一些方面，接头将两个mhc i类表位编码核酸序列或一个mhc i类表位编码核酸序列连接至一个mhc ii类表位编码核酸序列。在一些方面，接头选自由以下各项组成的组：(1)连续甘氨酸残基，长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基；(2)连续丙氨酸残基，长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基；(3)两个精氨酸残基(rr)；(4)丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸(aay)；(5)由哺乳动物蛋白酶体有效加工的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的共有序列；和(6)侧接源自同源蛋白的抗原并且长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，15、16、17、18、19、20个或2-20个氨基酸残基的一种或多种原生序列。在一些方面，接头包含一种或多种原生序列，所述天然序列侧接源自来源同源蛋白的抗原并且长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或2-20个氨基酸残基。在一些方面，接头将两个mhc ii类表位编码核酸序列或一个mhc ii类序列连接至mhc i类表位编码核酸序列。在一些方面，接头包含序列gppgg。
79、在一些方面，抗原编码核酸序列可操作地或直接地连接至增强表位编码核酸序列的表达、稳定性、细胞运输、加工和呈递和/或免疫原性的单独或连续的序列。在一些方面，所述单独或连续的序列包含以下至少一者：泛素序列、经修饰以增加蛋白酶体靶向的泛素序列(例如泛素序列在位置76处含有gly至ala取代)、免疫球蛋白信号序列(例如igk)、主要组织相容性i类序列、溶酶体相关膜蛋白(lamp)-1、人树突细胞溶酶体相关膜蛋白以及主要组织相容性ii类序列；任选地其中经修饰以增加蛋白酶体靶向的泛素序列是a76。
80、在一些方面，所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少2-10、2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗原编码核酸序列，任选地其中每种抗原-编码核酸序列编码不同的抗原编码核酸序列。在一些方面，所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400种抗原编码核酸序列，任选地其中每种抗原编码核酸序列编码不同的抗原编码核酸序列。在一些方面，所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400种抗原编码核酸序列。在一些方面，至少一种抗原编码核酸序列包含至少2-400种抗原编码核酸序列，并且其中所述抗原编码核酸序列中的至少两者编码由mhc i类呈递在细胞表面上的表位序列或其部分。在一些方面，每种抗原编码核酸序列独立地包含至少2-10、2、3、4、5、6、7、8、9或10种表位编码核酸序列，任选地其中每种表位编码核酸序列编码不同的表位编码核酸序列。在一些方面，每种抗原编码核酸序列独立地包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400种表位编码核酸序列，任选地其中每种表位编码核酸序列编码不同的表位编码核酸序列。在一些方面，每种抗原编码核酸序列独立地包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400种表位编码核酸序列。在一些方面，每种抗原编码核酸序列独立地包含至少2-400种表位编码核酸序列，并且其中所述表位编码核酸序列中的至少两者编码由mhc i类呈递在细胞表面上的表位序列或其部分。在一些方面，所述mhc i类表位中的至少两者由mhc i类呈递在细胞表面、任选地肿瘤细胞表面或受感染细胞表面上。
81、在一些方面，所述表位编码核酸序列包含至少一种mhc i类表位编码核酸序列，并且其中每种抗原编码核酸序列编码长度为8至35个氨基酸，任选地长度为9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸的多肽序列。在一些方面，存在至少一种mhc ii类表位编码核酸序列。在一些方面，所述至少一种mhc ii类表位编码核酸序列存在并包含至少一种mhc ii类表位编码核酸序列，所述mhc ii类表位编码核酸序列包含使所编码的表位序列与由野生型核酸序列编码的相应肽序列不同的至少一种改变。
82、在一些方面，所述表位编码核酸序列包含mhc ii类表位编码核酸序列，并且其中每种抗原编码核酸序列编码长度为12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40个氨基酸的多肽序列。
83、在一些方面，所述表位编码核酸序列包含mhc ii类表位编码核酸序列，其中存在至少一种mhc ii类表位编码核酸序列，并且其中所述至少一种mhc ii类表位编码核酸序列包含至少一种通用mhc ii类表位编码核酸序列，任选地其中所述至少一种通用序列包含破伤风类毒素和padre中的至少一者。
84、在一些方面，所述至少一种启动子核苷酸序列或所述第二启动子核苷酸序列是诱导型的。在一些方面，所述至少一种启动子核苷酸序列或所述第二启动子核苷酸序列是非诱导型的。在一些方面，聚(a)序列包含所述自复制病毒原生的聚(a)序列。在一些方面，所述至少一种聚(a)序列包含所述自复制病毒外源的聚(a)序列。在一些方面，所述至少一种聚(a)序列可操作地连接至所述至少一种核酸序列中的至少一者。在一些方面，所述至少一种聚(a)序列是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个或至少120个连续a核苷酸。在一些方面，所述至少一种聚(a)序列是至少80个连续a核苷酸。
85、在一些方面，所述表位编码核酸序列包含mhc i类表位编码核酸序列，并且其中所述mhc i类表位编码核酸序列是通过执行以下步骤来选择的：
86、(a)从肿瘤、受感染细胞或感染性疾病生物体获得外显子组、转录组或全基因组核苷酸测序数据中的至少一者，其中所述核苷酸测序数据用于获得代表一组表位中的每一者的肽序列的数据；
87、(b)将每个表位的肽序列输入到呈递模型中，以产生所述表位中的每一者由mhc等位基因中的一者或多者在细胞表面、任选地肿瘤细胞表面或受感染细胞表面上呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及
88、(c)基于所述数值可能性集合选择所述表位集合的子集以产生经选择表位集合，所述经选择表位用于产生所述mhc i类表位编码核酸序列。
89、在一些方面，所述mhc i类表位编码核酸序列中的每一者是通过执行以下步骤来选择：
90、(a)从肿瘤、受感染细胞或感染性疾病生物体获得外显子组、转录组或全基因组核苷酸测序数据中的至少一者，其中所述核苷酸测序数据用于获得代表一组表位中的每一者的肽序列的数据；
91、(b)将每个表位的肽序列输入到呈递模型中，以产生所述表位中的每一者由mhc等位基因中的一者或多者在细胞表面、任选地肿瘤细胞表面或受感染细胞表面上呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及
92、(c)基于所述数值可能性集合选择所述表位集合的子集以产生经选择表位集合，所述经选择表位用于产生至少20种mhc i类表位编码核酸序列。
93、在一些方面，所述经选择表位集合的数目为2-20。在一些方面，所述呈递模型表示以下两者之间的依赖性：
94、(a)所述mhc等位基因中的特定一者和在肽序列的特定位置处的特定氨基酸的一对的存在；和
95、(b)由所述对的所述mhc等位基因中的所述特定一者将在所述特定位置处包含所述特定氨基酸的所述肽序列呈递在细胞表面、任选地肿瘤细胞表面或受感染细胞表面上的可能性。
96、在一些方面，选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位被呈递在细胞表面、任选地肿瘤细胞表面或受感染细胞表面上的可能性增加的表位。在一些方面，选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位能够在受试者中刺激肿瘤特异性或感染性疾病生物体特异性免疫响应的可能性增加的表位。在一些方面，选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位能够由专职抗原呈递细胞(apc)呈递给初始t细胞的可能性增加的表位，任选地其中所述apc是树突状细胞(dc)。在一些方面，选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位经由中心或外周耐受性受抑制的可能性降低的表位。在一些方面，选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位能够在受试者中刺激对正常组织的自身免疫响应的可能性降低的表位。在一些方面，外显子组或转录组核苷酸测序数据是通过对肿瘤细胞或组织、受感染细胞或感染性疾病生物体进行测序而获得的。在一些方面，所述测序是下一代测序(ngs)或任何大规模并行测序方法。
97、在一些方面，用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物作为初免疫苗施用。在一些方面，所述方法还包括施用第二组合物，任选地其中所述第二组合物是疫苗组合物。在一些方面，所述第二组合物是在用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物之前施用的。在一些方面，所述第二组合物是在施用用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物之后施用的。在一些方面，所述第二组合物与用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物相同。在一些方面，所述第二组合物与用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物不同。在一些方面，所述第二组合物包含所述自扩增表达系统的盒，任选地其中所述第二组合物包含编码所述自扩增表达系统的盒的黑猩猩腺病毒载体。在一些方面，施用两种或更多种第二组合物，任选地其中用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物作为初免疫苗施用。
98、在一些方面，用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物是肌内(im)、皮内(id)、皮下(sc)、玻璃体内(ivt)、鞘内或静脉内(iv)施用的。在一些方面，所述方法还包括施用免疫调节剂，任选地其中所述免疫调节剂是抗ctla4抗体或其抗原结合片段、抗pd-1抗体或其抗原结合片段、抗pd-l1抗体或其抗原结合片段、抗4-1bb抗体或其抗原结合片段、抗ox-40抗体或其抗原结合片段、或细胞因子，任选地其中所述细胞因子是il-2、il-7、il-12、il-15或il-21或其变体中的至少一者。在一些方面，所述方法还包括施用佐剂。
1.一种用于递送包含单链rna(ssrna)载体的自扩增表达系统的组合物，其中所述ssrna载体包含7-甲基鸟苷酸(m7g帽)、聚腺苷酸化(聚a)尾、自扩增骨架以及一种或多种经修饰核苷，其中所述一种或多种经修饰核苷包括m5c并且不包括其他经修饰核苷酸，任选地除了m7g帽类似物之外。
2.一种用于递送包含单链rna(ssrna)载体的自扩增表达系统的组合物，其中所述ssrna载体包含7-甲基鸟苷酸(m7g帽)、聚腺苷酸化(聚a)尾、自扩增骨架和一种或多种经修饰核苷。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述自扩增骨架包含选自自复制rna病毒的多核苷酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述自复制rna病毒选自包括甲病毒、黄病毒、麻疹病毒和弹状病毒的组。
5.如权利要求2-4中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种经修饰核苷包括甲基-5-胞嘧啶(m5c)、甲基-6-腺苷(m6a)、核糖-甲基化(2'-o-me)、s-硫尿苷(s2u)、5-甲基尿苷(m5u)、n1-甲基假尿苷(m1ψ)、假尿苷(ψ)或其任何组合。
6.如权利要求2-4中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种经修饰核苷包括m5c。
7.如权利要求2-4中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种经修饰核苷包括m5c并且不包括其他经修饰核苷酸，任选地除了m7g帽类似物之外。
8.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体是纯化的。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述ssrna载体通过色谱来纯化。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述色谱包括纤维素色谱系统或基于亲和力的分离系统。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述基于亲和力的分离系统是脱氧胸苷(dt)寡核苷酸(oligo(dt))系统。
12.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体的大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞苷和/或尿苷核苷是经修饰核苷。
13.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体的大于25％的腺苷、鸟苷、胞苷和/或尿苷核苷包含经修饰核苷。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述ssrna载体的100％的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞苷和/或尿苷核苷包含经修饰核苷。
15.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体包含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的胞苷核苷包含经修饰核苷。
16.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体的大于25％的胞苷核苷包含经修饰核苷。
17.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna包含100％的胞苷核苷是经修饰核苷。
18.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、小于0.5％、或小于0.1％的污染物。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述污染物包括盐、洗涤剂和/或双链rna(dsrna)。
20.如权利要求18所述的组合物，其中所述污染物包括dsrna。
21.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体占所述组合物中存在的总rna的70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、或95％或更多。
22.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体占所述组合物中存在的总rna的97％或更多、98％或更多、99％或更多、或99.5％或更多。
23.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体是所述组合物中存在的唯一rna种类。
24.如权利要求18-23中任一项所述的组合物，其中所述总rna、dsrna和/或ssrna含量通过斑点印迹或elisa来评估，任选地其中所述斑点印迹或elisa评估包括用对rna、dsrna和/或ssrna具有特异性的抗体进行检测。
25.如权利要求18-23中任一项所述的组合物，其中所述总rna、dsrna和/或ssrna含量通过毛细管电泳来评估。
26.如权利要求18-23中任一项所述的组合物，其中所述总rna、dsrna和/或ssrna含量通过液相色谱来评估。
27.如权利要求24或26中任一项所述的组合物，其中所述rna、dsrna和/或ssrna含量被量化为曲线下面积(auc)。
28.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体通过体外转录产生。
29.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述m7g帽包含m7g帽类似物。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述m7g帽类似物包括三核苷酸m7g-ppp-a-u帽类似物或二核苷酸m7g-ppp-a帽类似物。
31.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssrna载体包含盒，所述盒包含至少一种用于递送的核酸序列，任选地其中所述至少一种核酸序列包含多肽编码核酸序列，任选地其中所述多肽编码核酸序列是抗原编码核酸序列，并且其中所述盒可操作地连接至所述自扩增骨架或可操作地插入至所述自扩增骨架中。
32.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述自扩增骨架包含选自自复制rna病毒的多核苷酸，其包含至少一种由下式从5’至3’描述的核酸序列：
33.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含纳米粒子递送媒介物。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述纳米粒子递送媒介物是脂质纳米粒子(lnp)。
35.一种药物组合物，所述药物组合物包含如前述权利要求中任一项所述的组合物和药学上可接受的载剂。
36.一种用于治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的如前述组合物权利要求中任一项所述的组合物或如权利要求35所述的药物组合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述疾病为癌症或感染性疾病。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述感染性疾病由选自包括以下的组的病毒引起：hpv、流感、tb、cmv、hmpv、piv、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、sars-cov-2和泛冠状病毒。
39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述ssrna载体的量为1000μg或更少、100μg或更少、50μg或更少、30μg或更少、10μg或更少、5μg或更少、或1μg或更少。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中与接受包含不含经修饰核苷的核酸序列的组合物的对照受试者相比，所述受试者中的先天性免疫响应降低。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述先天性免疫响应是ifn响应。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述ifn响应是irf-3表达、irf-7表达或其组合。
43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中与包含另外相同的ssrna载体但不包含经修饰核苷的对照组合物相比，所述ssrna载体的复制增加。
44.一种从核酸混合物中纯化自扩增表达系统的方法，所述方法包括通过纤维素色谱系统或基于亲和力的分离系统纯化所述自扩增表达系统，其中所述自扩增表达系统包含单链rna(ssrna)载体，并且其中所述ssrna载体包含m7g帽、聚a尾和自扩增骨架。
45.一种减少核酸混合物中的双链rna(dsrna)的方法，所述方法包括：
46.如权利要求44或45所述的方法，其中所述基于亲和力的分离系统包括脱氧胸苷(dt)寡核苷酸(oligo(dt))系统。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述ssrna载体包含经修饰核苷。
48.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述经修饰核苷包括甲基-5-胞嘧啶(m5c)、甲基-6-腺苷(m6a)、核糖-甲基化(2'-o-me)、s-硫尿苷(s2u)、5-甲基尿苷(m5u)、n1-甲基假尿苷(m1ψ)、假尿苷(ψ)或其任何组合。
49.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述经修饰核苷由甲基-5-胞嘧啶(m5c)组成。
50.一种组合物混合物，其中所述组合物包含自扩增表达系统，所述自扩增表达系统包含：
51.一种组合物混合物，其中所述组合物包含自扩增表达系统，所述自扩增表达系统包含：
52.如权利要求50或51所述的混合物，其中所述唯一可检测的rna包含所述ssrna载体。
53.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述总rna、dsrna和/或ssrna含量通过斑点印迹或elisa来评估，任选地其中所述斑点印迹或elisa评估包括用对rna、dsrna和/或ssrna具有特异性的抗体进行检测。
54.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述总rna、dsrna和/或ssrna含量通过毛细管电泳来评估。
55.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述总rna、dsrna和/或ssrna含量通过液相色谱来评估。
56.如权利要求53-55中任一项所述的组合物，其中所述rna、dsrna和/或ssrna含量被量化为曲线下面积(auc)。
57.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述ssrna通过体外转录产生。
58.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述m7g帽包含m7g帽类似物。
59.如权利要求58所述的混合物，其中所述m7g帽类似物包括三核苷酸m7g-ppp-a-u帽类似物或二核苷酸m7g-ppp-a帽类似物。
60.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述ssrna载体包含盒，所述盒包含至少一种用于递送的核酸序列，任选地其中所述至少一种核酸序列包含多肽编码核酸序列，任选地其中所述多肽编码核酸序列是抗原编码核酸序列，并且其中所述盒可操作地连接至所述自扩增骨架或可操作地插入至所述自扩增骨架中。
61.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述自扩增骨架包含选自自复制rna病毒的多核苷酸，其包含至少一种由下式从5’至3’描述的核酸序列：
62.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述ssrna载体包含一种或多种经修饰核苷。
63.如权利要求62所述的混合物，其中所述一种或多种经修饰核苷包括甲基-5-胞嘧啶(m5c)、甲基-6-腺苷(m6a)、核糖-甲基化(2'-o-me)、s-硫尿苷(s2u)、5-甲基尿苷(m5u)、n1-甲基假尿苷(m1ψ)、假尿苷(ψ)或其任何组合。
64.如权利要求62所述的混合物，其中所述一种或多种经修饰核苷包括m5c。
65.如权利要求62所述的混合物，其中所述一种或多种经修饰核苷包括m5c并且不包括其他经修饰核苷酸，任选地除了帽类似物之外。
66.如上述权利要求中任一项所述的混合物，其中所述ssrna载体是纯化的。
67.如权利要求66所述的混合物，其中所述ssrna载体通过色谱来纯化。
68.如权利要求67所述的混合物，其中所述色谱包括纤维素色谱系统或基于亲和力的分离系统。
69.如权利要求68所述的混合物，其中所述基于亲和力的分离系统是脱氧胸苷(dt)寡核苷酸(oligo(dt))系统。
70.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，
71.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物中的所述盒的每个元件的有序序列描述于下式，从5’至3’包含：
72.如权利要求71所述的组合物，其中对于每个x，相应的nc是不同的mhc i类表位编码核酸序列。
73.如权利要求71或72所述的组合物，其中对于每个y，相应的uf是不同的mhc ii类表位编码核酸序列。
74.如权利要求71-73中任一项所述的组合物，其中
75.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中用于递送的所述至少一种核酸序列包含多肽编码核酸序列。
76.如权利要求75所述的组合物，其中所述多肽编码核酸序列编码所述抗原编码核酸序列。
77.如权利要求76所述的组合物，其中所述抗原编码核酸序列包含mhc i类表位、mhcii类表位、能够刺激b细胞响应的表位或其组合。
78.如权利要求76或77所述的组合物，其中所述抗原编码核酸序列包含编码全长蛋白质、蛋白质亚基、蛋白质结构域或其组合的序列。
79.如权利要求75所述的组合物，其中所述多肽编码核酸序列编码全长蛋白质或其功能部分。
80.如权利要求79所述的组合物，其中所述全长蛋白质或其功能部分选自由以下各项组成的组：抗体、细胞因子、嵌合抗原受体(car)、t细胞受体和基因组编辑系统核酸酶。
81.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中用于递送的所述至少一种核酸序列包含至少一种包含非编码核酸序列的核酸序列。
82.如权利要求81所述的组合物，其中所述非编码核酸序列是rna干扰(rnai)多核苷酸或基因组编辑系统多核苷酸。
83.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述lnp包含选自由以下各项组成的组的脂质：可电离氨基脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇、基于peg的外壳脂质或其组合。
84.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述lnp包含可电离氨基脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和基于peg的外壳脂质。
85.如权利要求83或84所述的组合物，其中所述可电离氨基脂质包含mc3样(二亚油醇甲基-4-二甲基氨基丁酸酯)分子。
86.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述lnp包封的表达系统具有60-140nm之间的直径。
87.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物被配制用于肌内(im)、皮内(id)、皮下(sc)、玻璃体内(ivt)、鞘内或静脉内(iv)施用。
88.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物被配制用于肌内(im)施用。
89.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述盒整合在所述至少一种启动子核苷酸序列和所述至少一种聚(a)序列之间。
90.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种启动子核苷酸序列可操作地连接至所述盒。
91.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述ssrna载体包含正链rna载体。
92.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述ssrna载体包含负链rna载体。
93.如权利要求92所述的组合物，其中所述负链rna载体包含麻疹病毒或弹状病毒的至少一种多核苷酸序列。
94.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述ssrna载体在哺乳动物细胞内自扩增。
95.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述自复制rna病毒选自由以下各项组成的组：甲病毒；黄病毒、麻疹病毒和弹状病毒。
96.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述自扩增骨架包含甲病毒的至少一种多核苷酸序列，任选地其中所述甲病毒选自由以下各项组成的组：奥拉病毒、摩根堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和马雅罗病毒。
97.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述自扩增骨架包含委内瑞拉马脑炎病毒的至少一种核苷酸序列。
98.如权利要求96或97所述的组合物，其中所述自扩增骨架至少包含由所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的核苷酸序列编码的用于非结构蛋白介导的扩增的序列、亚基因组启动子序列、聚(a)序列、非结构蛋白1(nsp1)基因、nsp2基因、nsp3基因和nsp4基因。
99.如权利要求96或97所述的组合物，其中所述自扩增骨架至少包含由所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的核苷酸序列编码的用于非结构蛋白介导的扩增的序列、亚基因组启动子序列和聚(a)序列。
100.如权利要求98或99所述的组合物，其中用于非结构蛋白介导的扩增的序列选自由以下各项组成的组：甲病毒5’utr、51-nt cse、24-nt cse、26s亚基因组启动子序列、19-ntcse、甲病毒3’utr或其组合。
101.如权利要求98-100中任一项所述的组合物，其中所述自扩增骨架不编码结构性病毒粒子蛋白衣壳e2和e1，任选地其中e1是全长e1，或不编码结构性病毒粒子蛋白衣壳e3、e2、6k。
102.如权利要求101所述的组合物，其中所述盒被插入以代替所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的多核苷酸序列内的结构性病毒粒子蛋白。
103.如权利要求96或97所述的组合物，其中所述委内瑞拉马脑炎病毒包含seq id no:3或seq id no:5的序列。
104.如权利要求96或97所述的组合物，其中所述委内瑞拉马脑炎病毒包含seq id no:3或seq id no:5的序列，其还包含碱基对7544和11175之间的缺失。
105.如权利要求104所述的组合物，其中所述自扩增骨架包含seq id no:6或seq idno:7所示的序列。
106.如权利要求104或105的组合物，其中所述盒被插入在seq id no:6或seq id no:7中的位置7544处。
107.如权利要求102-106所述的组合物，其中所述盒的插入提供了包含nsp1-4基因和至少一种核酸序列的多顺反子rna的转录，其中所述nsp1-4基因和用于递送的所述至少一种核酸序列在单独的开放阅读框中。
108.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述ssrna载体包含至少一种启动子核苷酸序列。
109.如权利要求108中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种启动子核苷酸序列包含由所述自复制rna病毒编码的原生启动子核苷酸序列，任选地其中所述原生启动子核苷酸序列是亚基因组启动子核苷酸序列。
110.如权利要求108中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种启动子核苷酸序列是外源rna启动子。
111.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述ssrna载体包含第二启动子序列，任选地其中所述第二启动子核苷酸序列是亚基因组启动子核苷酸序列。
112.如权利要求111所述的组合物、混合物或方法，其中所述第二启动子核苷酸序列包含多个亚基因组启动子核苷酸序列，其中每个亚基因组启动子核苷酸序列提供所述单独的开放阅读框中的一者或多者的转录。
113.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种抗原编码核酸序列包含两种或更多种抗原编码核酸序列。
114.如权利要求113所述的组合物，其中每种抗原编码核酸序列彼此直接连接。
115.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中每种抗原编码核酸序列用编码接头的核酸序列连接至不同的抗原编码核酸序列。
116.如权利要求115所述的组合物，其中所述接头将两个mhc i类表位编码核酸序列或一个mhc i类表位编码核酸序列连接至一个mhc ii类表位编码核酸序列。
117.如权利要求116所述的组合物，其中所述接头选自由以下各项组成的组：(1)连续甘氨酸残基，长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基；(2)连续丙氨酸残基，长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基；(3)两个精氨酸残基(rr)；(4)丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸(aay)；(5)由哺乳动物蛋白酶体有效加工的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的共有序列；和(6)侧接源自同源蛋白的抗原并且长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或2-20个氨基酸残基的一种或
118.如权利要求116所述的组合物，其中所述接头包含一种或多种原生序列，所述原生序列侧接源自来源同源蛋白的抗原并且长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或2-20个氨基酸残基。
119.如权利要求115所述的组合物，其中所述接头将两个mhcii类表位编码核酸序列或一个mhc ii类序列连接至一个mhc i类表位编码核酸序列。
120.如权利要求119所述的组合物，其中所述接头包含序列gppgg。
121.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述抗原编码核酸序列可操作地或直接地连接至增强所述表位编码核酸序列的表达、稳定性、细胞运输、加工和呈递和/或免疫原性的单独或连续的序列。
122.如权利要求121所述的组合物，其中所述单独或连续的序列包含以下中的至少一者：泛素序列、经修饰以增加蛋白酶体靶向的泛素序列(例如，所述泛素序列在位置76处含有gly至ala取代)、免疫球蛋白信号序列(例如，igk)、主要组织相容性i类序列、溶酶体相关膜蛋白(lamp)-1、人树突状细胞溶酶体相关膜蛋白和主要组织相容性ii类序列；任选地其中所述经修饰以增加蛋白酶体靶向的泛素序列是a76。
123.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少2-10、2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗原编码核酸序列，任选地其中每种抗原编码核酸序列编码不同的抗原编码核酸序列。
124.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400种抗原编码核酸序列，任选地其中每种抗原编码核酸序列编码不同的抗原编码核酸序列。
125.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400种抗原编码核酸序列。
126.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少2-400种抗原编码核酸序列，并且其中所述抗原编码核酸序列中的至少两者编码由mhc i类呈递在细胞表面上的表位序列或其部分。
127.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中每种抗原编码核酸序列独立地包含至少2-10、2、3、4、5、6、7、8、9或10种表位编码核酸序列，任选地其中每种表位编码核酸序列编码不同的表位编码核酸序列。
128.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中每种抗原编码核酸序列独立地包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400种表位编码核酸序列，任选地其中每种表位编码核酸序列编码不同的表位编码核酸序列。
129.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中每种抗原编码核酸序列独立地包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400种表位编码核酸序列。
130.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中每种抗原编码核酸序列独立地包含至少2-400种表位编码核酸序列，并且其中所述表位编码核酸序列中的至少两者编码由mhc i类呈递在细胞表面上的表位序列或其部分。
131.如74所述的组合物，其中所述mhc i类表位中的至少两者由mhc i类呈递在细胞表面、任选地肿瘤细胞表面或受感染细胞表面上。
132.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述表位编码核酸序列包含至少一种mhc i类表位编码核酸序列，并且其中每种抗原编码核酸序列编码长度为8至35个氨基酸，任选地长度为9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸的多肽序列。
133.如权利要求71-73或83-132中任一项所述的组合物，其中存在所述至少一种mhcii类表位编码核酸序列。
134.如权利要求71-73或83-132中任一项所述的组合物，其中所述至少一种mhc ii类表位编码核酸序列存在并包含至少一种mhc ii类表位编码核酸序列，所述mhc ii类表位编码核酸序列包含使所编码的表位序列与由野生型核酸序列编码的相应肽序列不同的至少一种改变。
135.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述表位编码核酸序列包含mhc ii类表位编码核酸序列，并且其中每种抗原编码核酸序列编码长度为12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40个氨基酸的多肽序列。
136.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述表位编码核酸序列包含mhc ii类表位编码核酸序列，其中存在至少一种mhc ii类表位编码核酸序列，并且其中所述至少一种mhc ii类表位编码核酸序列包含至少一种通用mhc ii类表位编码核酸序列，任选地其中所述至少一种通用序列包含破伤风类毒素和padre中的至少一者。
137.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种启动子核苷酸序列或所述第二启动子核苷酸序列是诱导型的。
138.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种启动子核苷酸序列或所述第二启动子核苷酸序列是非诱导型的。
139.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述聚(a)序列包含所述自复制病毒原生的聚(a)序列。
140.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种聚(a)序列包含所述自复制病毒外源的聚(a)序列。
141.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种聚(a)序列可操作地连接至所述至少一种核酸序列中的至少一者。
142.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种聚(a)序列是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个或至少120个连续a核苷酸。
143.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述至少一种聚(a)序列是至少80个连续a核苷酸。
144.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述表位编码核酸序列包含mhc i类表位编码核酸序列，并且其中所述mhc i类表位编码核酸序列是通过执行以下步骤来选择的：
145.如权利要求74所述的组合物，其中所述mhc i类表位编码核酸序列中的每一者是通过执行以下步骤来选择：
146.如权利要求144所述的组合物，其中所述经选择表位集合的数目为2-20。
147.如权利要求144-146中任一项所述的组合物，其中所述呈递模型表示以下两者之间的依赖性：
148.如权利要求144-147中任一项所述的组合物，其中选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位被呈递在细胞表面、任选地肿瘤细胞表面或受感染细胞表面上的可能性增加的表位。
149.如权利要求144-148中任一项所述的组合物，其中选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位能够在受试者中刺激肿瘤特异性或感染性疾病生物体特异性免疫响应的可能性增加的表位。
150.如权利要求144-149中任一项所述的组合物，其中选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位能够由专职抗原呈递细胞(apc)呈递给初始t细胞的可能性增加的表位，任选地其中所述apc是树突状细胞(dc)。
151.如权利要求144-150中任一项所述的组合物，其中选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位经由中心或外周耐受性受抑制的可能性降低的表位。
152.如权利要求144-151中任一项所述的组合物，其中选择所述经选择表位集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的表位能够在受试者中刺激对正常组织的自身免疫响应的可能性降低的表位。
153.如权利要求144-152中任一项所述的组合物，其中外显子组或转录组核苷酸测序数据是通过对肿瘤细胞或组织、受感染细胞或感染性疾病生物体进行测序而获得的。
154.如权利要求153所述的组合物，其中所述测序是下一代测序(ngs)或任何大规模并行测序方法。
155.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物作为初免疫苗施用。
156.如上述权利要求中任一项所述的组合物、混合物或方法，其中所述方法还包括施用第二组合物，任选地其中所述第二组合物是疫苗组合物。
157.如权利要求156所述的方法，其中所述第二组合物是在用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物之前施用的。
158.如权利要求156所述的方法，其中所述第二组合物是在施用用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物之后施用的。
159.如权利要求156-158中任一项所述的方法，其中所述第二组合物与用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物相同。
160.如权利要求156-158中任一项所述的方法，其中所述第二组合物与用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物不同。
161.如权利要求160所述的方法，其中所述第二组合物包含所述自扩增表达系统的盒，任选地其中所述第二组合物包含编码所述自扩增表达系统的盒的黑猩猩腺病毒载体。
162.如权利要求156-161中任一项所述的方法，其中施用两种或更多种第二组合物，任选地其中用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物作为初免疫苗施用。
163.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中用于递送所述自扩增表达系统的所述组合物是肌内(im)、皮内(id)、皮下(sc)、玻璃体内(ivt)、鞘内或静脉内(iv)施用的。
164.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用免疫调节剂，任选地其中所述免疫调节剂是抗ctla4抗体或其抗原结合片段、抗pd-1抗体或其抗原结合片段、抗pd-l1抗体或其抗原结合片段、抗4-1bb抗体或其抗原结合片段、抗ox-40抗体或其抗原结合片段、或细胞因子，任选地其中所述细胞因子是il-2、il-7、il-12、il-15或il-21或其变体中的至少一者。
165.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用佐剂。
