【】本发明涉及用于检测试样中的核酸的对象碱基序列中的相对于标准碱基序列的变异的方法、及在核酸扩增反应中，选择性地抑制具有对象碱基序列的核酸的扩增的方法、以及用于实施这些的试剂盒。更具体而言，涉及通过在使用夹核酸(有时也称为阻断剂核酸)的核酸扩增反应中，在特定的二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物的存在下进行核酸扩增，检测对象碱基序列中的相对于标准碱基序列的变异的方法及选择性地抑制具有对象碱基序列的核酸的扩增的方法、以及用于实施这些的试剂盒。
背景技术
0、
背景技术：
1、基因的突变有成为癌的起因时，期待通过早期发现这样的基因的突变，与癌的早期治疗关联。另外得知，某特定的基因的变异与与某种疾病的易罹患、药的治疗效果、副作用的强弱等大相关。例如知晓，作为上皮生长因子受体(egfr)的酪氨酸激酶抑制剂的吉非替尼(商品名：易瑞沙)在具有特定的基因变异的一部分的肺癌患者中显示大的功效，但在约0.5％左右的患者中引起重度的间质性肺炎(非专利文献1)。另外知晓，在大肠癌中，kras基因有变异，则分子目标药西妥昔单抗(商品名：爱必妥)的奏效率低，无变异，则奏效率高。因此，只要是可每患者预测功效或副作用，就控制向无法期待功效的患者或预计重度的副作用的患者的施用而进行副作用少的有效的治疗变得可能。
2、从这认识到，弄清楚基因的变异在癌的早期发现、治疗效率的提升等的面重要，为对应于这样的需求，进行检测基因的变异的各种各样的技术开发。特别是，在如pcr法一样的基因扩增技术、及ngs等的整体的基因解析技术中见到显著的进展。
3、当然，在从肿瘤受试体提取的基因中含大量的野生型基因和微量的变异型基因，在以往的检测变异型基因的方法中，想要检测微量的变异型基因依然是多不具有充分的灵敏度。例如，作为检测基因的变异的方法之一，有在非选择性地扩增变异型基因和野生型基因之后，用电泳法或杂交法等将变异型基因与野生型基因区别的方法，在此方法中，将野生型基因中所含的极其少量的变异型基因用充分的灵敏度及精度检测困难。
4、与此相比，开发了在基因扩增的阶段，使用具有与野生型基因的基准序列互补的碱基序列的人工的寡核苷酸抑制野生型基因的扩增而对变异型基因选择性地进行扩增的所谓的“夹法”。在此方法中使用的人工核酸称为夹核酸，具有核酸扩增过程中(i)与野生型基因强杂交，(ii)不与变异型基因强杂交，(iii)核酸扩增过程中难分解这样的特性，利用其实施实时pcr，则可检测变异型基因的频度变异至1％，再者以实时pcr的扩增产物作为模板而实施直接测序法，则视为可检测变异型基因的频度变异至0.1％(例如，专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。作为夹核酸，开发了肽核酸(peptide nucleic acid，pna)、锁核酸(locked nucleic acid，lna)及桥核酸(bridged nucleic acid，bna)，开发了pna-lna夹pcr法、bna夹pcr法等的扩增法(参照例如，非专利文献2、3、6及专利文献1～9)。
5、但是，由这些夹法也在作为试样中的相对于野生型基因的比率而变异型基因的比率非常地低的情况中实施实时pcr，则对野生型基因进行了扩增，但有无法区别野生型基因和变异型基因的情况。另外，以夹pcr的扩增产物作为模板实施直接测序法，则可升高变异型基因的检测灵敏度，序列确定不适宜于要求现场处理庞大的受试体的临床场合。
6、【现有技术文献】
7、【专利文献】
8、【专利文献1】专利第6242336号
9、【专利文献2】专利第5813263号
10、【专利文献3】专利第4731324号
11、【专利文献4】专利第4383178号
12、【专利文献5】专利第5030998号
13、【专利文献6】专利第4151751号
14、【专利文献7】特开第2001-89496号公报
15、【专利文献8】国际公开第2003/068795号单行本
16、【专利文献9】国际公开第2005/021570号单行本
17、【专利文献10】专利第3756313号
18、【专利文献11】国际公开第2016/167320号单行本
19、【非专利文献】
20、【非专利文献1】thomas j.，et.al.，2004,the new england jurnal ofmedicine,350；21
21、【非专利文献2】nagai k.，et.al.，2005,cancer research,65：7276-7282
22、【非专利文献3】nishino k.et al.，2019,肺癌患者中的egfr基因变异检查的手减第4.1版
23、【非专利文献4】luming z.et al.，2011biotechniques,50：311-318
24、【非专利文献5】nagakubo y.et al.，2019,bmc medical genomics,12：162
25、【非专利文献6】murina f.f.et al.,2020,molecules,25(4)：786
26、【发明的概要】
27、【发明要解决的课题】
28、这样，在临床或研究的现场中，在试样中的相对于野生型基因的比率而变异型基因的比率非常地低的情况中，也有对于可检测变异型基因的方法的需求，推进与其相对应的方法的研究(专利文献2、非专利文献4、及非专利文献5)。但是，以往的方法，为了高灵敏度检测变异型基因，以高额的机器或2阶段以上的复杂的解析步骤作为必要(非专利文献2)，在临床的现场或研究的场所要求能用简易的方法以高灵敏度检测试样中的变异型基因的方法。
29、从而，本发明旨在提供可用比由以往的夹法的变异型基因的检测界限低的变异型基因含有率检测变异型基因的简便的方法及用于实施其的试剂盒。
30、本发明还旨在提供可在核酸扩增反应中选择性地抑制作为对象的碱基序列的扩增的简便的方法及用于实施其的试剂盒。
31、【用于解决课题的手段】
32、本发明人在对于升高由夹法的变异型基因的检测灵敏度的方法重复探讨之中，与夹核酸一同在特定的二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物的存在下实施核酸扩增反应时，选择性地抑制野生型基因的扩增的由夹核酸的效果由所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物的存在增强，由此成功提高变异型基因的检测灵敏度，从而完成本发明。
33、即，本发明提供以下的方法、试剂盒、增强剂及使用。
34、[1]检测试样中的核酸的对象碱基序列中的相对于标准碱基序列的变异的方法，其包括使用下列物质，进行以上述试样中的核酸作为模板的核酸扩增反应：
35、夹核酸，其含与上述标准碱基序列互补的碱基序列，含至少1个残基的非天然型核苷酸，及
36、含以下构成单元的二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物：
37、具有通式(i-a)或通式(i-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(a)：
38、【化1】
39、
40、(式中，r1表示任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)，和
41、具有通式(i-c)所表示的结构的构成单元(b)：
42、【化2】
43、
44、基于由上述核酸扩增反应得到的核酸扩增产物的总量、至上述核酸扩增产物的总量达阈值的上述核酸扩增反应的扩增循环数、上述核酸扩增产物中的具有上述变异的核酸的量、或者至上述核酸扩增产物中的具有上述变异的核酸的量达阈值的上述核酸扩增反应的扩增循环数，判定上述变异的存在。
45、[2][1]所述的检测方法，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物、或者二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
46、[3][1]所述的检测方法，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
47、[4][1]～[3]之任一项所述的检测方法，其中上述非天然型核苷酸是bna。
48、[5][1]～[4]之任一项所述的检测方法，其中将上述核酸扩增用实时pcr进行。
49、[6][1]～[5]之任一项所述的检测方法，其中上述试样中的核酸是基因组dna。
50、[7][1]～[6]之任一项所述的检测方法，其中
51、在进行上述核酸扩增反应时，还进行以具有上述标准碱基序列的核酸作为模板的核酸扩增反应，
52、在至将上述试样中的核酸用于模板时的上述核酸扩增产物的总量达阈值的上述核酸扩增反应的扩增循环数与至将具有上述标准碱基序列的核酸用于模板时的上述核酸扩增产物的总量达阈值的上述核酸扩增反应的扩增循环数相比较少时，判定为在上述试样中的核酸的对象碱基序列上存在上述变异。
53、[8]用于检测试样中的核酸的对象碱基序列中的相对于标准碱基序列的变异的试剂盒，其含：
54、夹核酸，其具有与上述标准碱基序列互补的碱基序列，含至少1个残基的非天然型核苷酸，及
55、含以下构成单元的二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物：
56、具有通式(i-a)或通式(i-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(a)：
57、【化3】
58、
59、(式中，r1表示任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)、及
60、具有通式(i-c)所表示的结构的构成单元(b)：
61、【化4】
62、
63、[9][8]所述的试剂盒，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
64、[10][9]所述的试剂盒，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
65、[11][8]～[10]之任一项所述的试剂盒，其中上述非天然型核苷酸是bna。
66、[12]在核酸扩增反应中，抑制具有指定的对象碱基序列的试样中的核酸的扩增的方法，其包括使用下列物质进行以上述核酸作为模板的核酸扩增反应：
67、夹核酸，其具有与上述对象碱基序列互补的碱基序列，含至少1个残基的非天然型核苷酸，及
68、含以下构成单元的二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物：
69、具有通式(i-a)或(i-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(a)：
70、【化5】
71、
72、(式中，r1表示任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)、和
73、具有通式(i-c)所表示的结构的构成单元(b)：
74、【化6】
75、
76、[13][12]所述的方法，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
77、[14][12]所述的方法，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、或者二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
78、[15][12]～[14]之任一项所述的方法，其中上述非天然型核苷酸是bna。
79、[16]用于在核酸扩增反应中抑制具有对象碱基序列的核酸的扩增的试剂盒，其含：
80、夹核酸，其具有与上述对象碱基序列互补的碱基序列，含至少1个残基的非天然型核苷酸，及
81、含以下构成单元的二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物：
82、具有通式(i-a)或通式(i-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(a)：
83、【化7】
84、
85、(式中，r1表示任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)、及
86、具有通式(i-c)所表示的结构的构成单元(b)：
87、【化8】
88、
89、[17][16]所述的试剂盒，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
90、[18][16]所述的试剂盒，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
91、[19][16]～[18]之任一项所述的试剂盒，其中上述非天然型核苷酸是bna。
92、[20]增强由夹核酸的核酸扩增抑制效果的核酸扩增抑制增强剂、更具体而言，其为增强由夹核酸抑制具有对象碱基序列的核酸的核酸扩增的效果的核酸扩增抑制增强剂，上述夹核酸具有与上述对象碱基序列互补的碱基序列，含至少1个残基的非天然型核苷酸，上述增强剂含二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物，上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物含：
93、具有通式(i-a)或通式(i-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(a)：
94、【化9】
95、
96、(式中，r1表示任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)，和
97、具有通式(i-c)所表示的结构的构成单元(b)：
98、【化10】
99、
100、[21][20]所述的增强剂，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
101、[22][20]所述的增强剂，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
102、[23]二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物在制造用于增强由夹核酸的核酸扩增抑制效果的核酸扩增抑制增强剂的用途，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物含：
103、具有通式(i-a)或通式(i-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(a)：
104、【化11】
105、
106、(式中，r1表示任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)，和
107、具有通式(i-c)所表示的结构的构成单元(b)：
108、【化12】
109、
110、[24][23]所述的用途，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
111、[25][23]所述的用途，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
112、[26]二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物用于增强由夹核酸的核酸扩增抑制效果的用途，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物含：
113、具有通式(i-a)或通式(i-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(a)：
114、【化13】
115、
116、(式中，r1表示任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)，和
117、具有通式(i-c)所表示的结构的构成单元(b)：
118、【化14】
119、
120、[27][26]所述的用途，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
121、[28][26]所述的用途，其中上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、或者，二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
122、上述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物其本身不抑制核酸扩增反应，但可选择性地增强抑制具有由夹核酸的与其互补的序列的核酸的扩增的效果。因此，根据本发明之一的实施方式，即使在试样中，对于具有与夹核酸互补的标准碱基序列的核酸，相对于标准碱基序列具有变异的核酸的比率非常地低的情况中(例如，0.1％以下)，由夹核酸选择性地抑制具有标准碱基序列的核酸的扩增，而具有相对于标准碱基序列的变异的核酸被按通常扩增，能以非常地高灵敏度用简易的方法进行具有变异的核酸的检测。
123、【附图的简单的说明】
124、【图1】a显示，在试验1中，作为不抑制pcr反应的情况的核酸扩增曲线的一例，使用实施例1的聚合物(二烯丙基甲基胺盐酸盐·二氧化硫共聚物)时的核酸扩增曲线。b显示，在试验1中，作为抑制pcr反应时的核酸扩增曲线的一例，使用比较例1的聚合物(二烯丙基胺盐酸盐·二氧化硫共聚物)时的核酸扩增曲线。
125、【图2】显示含bna的夹核酸(bna夹)的存在下、添加实施例1的聚合物(二烯丙基甲基胺盐酸盐·二氧化硫共聚物)，将kras变异型基因的含有率10％、1％、0.10％、0.01％或0％(wt)的模板dna用实时pcr反应扩增时的核酸扩增曲线。
126、【图3】a显示，在bna夹的存在下、聚合物未添加条件下，将braf变异型基因来源的dna的含有率10％、1％、0.10％、0.01％或0％(wt)的模板dna用实时pcr反应扩增时的核酸扩增曲线。b显示，bna夹的存在下、添加实施例1的聚合物(二烯丙基甲基胺盐酸盐·二氧化硫共聚物)，将braf变异型基因来源的dna的含有率10％、1％、0.10％、0.01％或0％(wt)的模板dna用实时pcr反应扩增时的核酸扩增曲线。
技术实现思路
1.检测试样中的核酸的对象碱基序列中的相对于标准碱基序列的变异的方法，其中，使用下列物质进行以所述试样中的核酸作为模板的核酸扩增反应：
2.权利要求1所述的检测方法，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物、或者二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
3.权利要求1所述的检测方法，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物或二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
4.权利要求1～3之任一项所述的检测方法，其中所述非天然型核苷酸是bna。
5.权利要求1～4之任一项所述的检测方法，其中将所述核酸扩增用实时pcr进行。
6.权利要求1～5之任一项所述的检测方法，其中所述试样中的核酸是基因组dna。
7.权利要求1～6之任一项所述的检测方法，其中在进行所述核酸扩增反应时，还进行以具有所述标准碱基序列的核酸作为模板的核酸扩增反应，
8.用于检测试样中的核酸的对象碱基序列中的相对于标准碱基序列的变异的试剂盒，其含：
9.权利要求8所述的试剂盒，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物或二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物或二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
11.权利要求8～10之任一项所述的试剂盒，其中所述非天然型核苷酸是bna。
12.在核酸扩增反应中抑制具有指定的对象碱基序列的试样中的核酸的扩增的方法，其中，使用下列物质进行以所述核酸作为模板的核酸扩增反应：
13.权利要求12所述的方法，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物或二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
14.权利要求12所述的方法，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、或者二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
15.权利要求12～14之任一项所述的方法，其中所述非天然型核苷酸是bna。
16.用于在核酸扩增反应中抑制具有对象碱基序列的核酸的扩增的试剂盒，其含：
17.权利要求16所述的试剂盒，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物或二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
18.权利要求16所述的试剂盒，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物或二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
19.权利要求16～18之任一项所述的试剂盒，其中所述非天然型核苷酸是bna。
20.增强由夹核酸抑制核酸扩增的效果的核酸扩增抑制增强剂，其含二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物，所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物含以下构成单元：
21.权利要求20所述的核酸扩增抑制增强剂，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物、二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物、二烯丙基乙基胺·二氧化硫共聚物或二烯丙基乙基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
22.权利要求20所述的核酸扩增抑制增强剂，其中所述二烯丙基胺类·二氧化硫共聚物是二烯丙基甲基胺·二氧化硫共聚物或二烯丙基甲基胺酸加成盐·二氧化硫共聚物。
