本发明涉及生物，尤其涉及一种phd2敲除的脐带间充质干细胞的制备方法。
背景技术：
1、间充质干细胞(mesenchymal stem cell,msc)是具有自我更新能力和来源于中胚层的多能成体干细胞，可分化成多种细胞类型，如软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞和其他细胞类型，因此被用于许多类型的研究，具有自我更新能力，具备多项分化潜能，可分化成多种类型的细胞。同时，其容易从多种组织获取和分离，如：骨髓、脂肪组织、牙髓及牙周膜、真皮、关节滑膜等；特定条件下，可分化为：脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。
2、间充质干细胞近年来作为一种细胞治疗的药物，在各种疾病中显示出了强大的治疗潜力，例如银屑病、关节炎、皮肤损伤。间充质干细胞分泌的vefga能够显著促进伤口愈合。人类的phd2蛋白是一种脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase domain protein)，由egln1基因编码，分子量约为46kd。研究发现，人体内phd2蛋白具有非常重要的生物学功能，与癌症等重要的疾病有紧密的联系，深入研究phd2蛋白的功能十分必要。有研究表明，降低phd2的表达能够有效促进vegfa的增多。
3、目前对于降低phd2表达水平的方法大致有以下几种：
4、(1)对转录后的mrna进行干扰，影响其翻译过程，代表性方法有：①sirna转染细胞，其维持周期短，细胞分裂后不具备遗传性；②shrna通过慢病毒形式转导入细胞中，存在病毒随机插入基因组的情况；
5、(2)对基因在dna水平进行改造，利用crispr/cas9系统；
6、①利用crispr/cas9质粒进行敲除，对于间充质干细胞来说其转染效率较低，效果容易不佳；
7、②利用慢病毒进行基因敲除，除了存在基因组有随即插入的风险，crispr/cas9系统在细胞内持续表达，也会增加脱靶效应。
8、中国专利cn114807230a公开了一种利用crispr-cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞tet2基因的方法，针对seq id no:1所示的tet2基因片段设计crispr-cas9靶标序列，接着合成带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个grna双链dna片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至lenticrispr v2载体中，获得靶向tet2基因两个不同位点的质粒lenticrispr v2-tet2-grna1、lenticrispr v2-tet2-grna2；将上述的质粒转染人骨髓间充质干细胞，培养24小时后，采用嘌呤霉素处理细胞进行药筛；将嘌呤霉素药筛后获得的贴壁细胞处理为细胞悬液，并提取细胞基因组dna进行鉴定。
9、因此，在本发明中选择使用电转将rnp复合物(核糖核蛋白复合体)转导入细胞的方式来对phd2基因的dna位点进行基因编辑，其转导效率高，且在dna水平进行操作其效果具有遗传性，同时也是car-t等临床实验在使用的方法，其安全性已经初步得到了验证。
技术实现思路
1、本发明提供了一种phd2敲除的脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
2、s1.制备rnp复合物；
3、s2.电转rnp复合物进入脐带间充质干细胞；
4、s3.提取脐带间充质干细胞的基因组dna并进行pcr扩增；
5、s4.检测脐带间充质干细胞中phd2的表达；
6、s5.q-pcr实验检测脐带间充质干细胞中vegfa的表达。
7、在一些实施方式中，所述phd2敲除的位点为：位点1：chr1:231,421,111-231,421,130，位点2：chr1:231,421,134-231,421,153，位点3：chr1:231,421,141-231,421,160。
8、在一些实施方式中，所述phd2敲除的序列为：crrna1的序列如seq id no.17所示，crrna2的序列如seq id no.18所示，crrna3的序列如seq id no.19所示。具体见表1。
9、本发明的敲除位点及敲除序列见图1。
10、在一些实施方式中，所述rnp复合物的制备原料包括：pbs、alt-r guide rna、alt-rcas9酶。
11、在一些实施方式中，所述pbs、alt-r guide rna、alt-rcas9酶的质量比为(2-2.5)：(1-1.5)：(1.5-2.0)。
12、在一些实施方式中，所述s3中pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性20sec，35个循环；55℃退火30sec，35个循环；72℃复性30sec，35个循环；72℃延伸5min，1个循环；4℃保存。
13、在一些实施方式中，所述s3中pcr扩增的引物序列如下：引物1-f的序列如seq idno.4所示，引物1-r的序列如seq id no.5所示，引物2-f的序列如seq id no.6所示，引物2-r的序列如seq id no.7所示，引物3-f的序列如seq id no.8所示，引物3-r的序列如seq idno.9所示，引物4-f的序列如seq id no.10所示，引物4-r的序列如seq id no.11所示，引物5-f的序列如seq id no.12所示，引物5-r的序列如seq id no.13所示，引物6-f的序列如seq id no.14所示，引物6-r的序列如seq id no.15所示。
14、seq id no.4-15的序列见表1。
15、表1
16、 序号 名称 序列 seq id no.1 crrna1 cgataagatcacctggatcg seq id no.2 crrna2 gactcgtccaaggacatccg seq id no.3 crrna3 ccttggacgagtcactcttc seq id no.4 引物1-f agtggaaaacagtggatacaaagg seq id no.5 引物1-r actggaagaagcacaagctcgt seq id no.6 引物2-f cttgctttgggtggtactct seq id no.7 引物2-r ttccaggagaaggcgaac seq id no.8 引物3-f cacaaggcagatgcagaacc seq id no.9 引物3-r agcgtcaggactggaagaag seq id no.10 引物4-f aatgtgatgagtggttcagacac seq id no.11 引物4-r agcgtcaggactggaagaag seq id no.12 引物5-f tgctttgggtggtactctaaca seq id no.13 引物5-r ttccaggagaaggcgaacc seq id no.14 引物6-f gaagtttgtgaacgggcagt seq id no.15 引物6-r cgcggccaagggaaaagtaaa
17、在一些实施方式中，所述s5中q-pcr实验引物的序列如下：hrplp0-f的序列如seqid no.16所示，hrplp0-r的序列如seq id no.17所示，hvegf-f的序列如seq id no.18所示，hvegf-r的序列如seq id no.19所示。
18、seq id no.16-19的序列见表2。
19、表2
20、 序号 引物名称 引物序列 seq id no.16 hrplp0-f cactgagatcagggacatgttg seq id no.17 hrplp0-r cttcacatggggcaatgg seq id no.18 hvegf-f aggaggagggcagaatcatc seq id no.19 hvegf-r atgtccaccagggtctcgat
21、在一些实施方式中，所述s5中q-pcr实验的反应程序为：95℃保持2min，1个循环；95℃保持15sec，40个循环；60℃保持1min，40个循环。
22、在一些实施方式中，所述s5中q-pcr实验的反应原料包括：qpcr mastermix、cdna、引物-f、引物r、去离子水，质量比为(9.5-12)：(1-3)：(0.5-1)：(6-8)。
23、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24、1.本发明中选择使用电转将rnp复合物转导入细胞的方式来对phd2基因的dna位点进行基因编辑，其转导效率高。
25、2.本发明在dna水平进行操作其效果具有遗传性，同时也是car-t等临床实验在使用的方法，其安全性已经初步得到了验证。
26、3.本发明电转后的脐带间充质干细胞其phd2表达水平下降，phd2的敲减效果显著。
27、4.本发明phd2敲减的脐带间充质干细胞，其vegfa的表达水平显著升高。
28、5.本发明具有良好的应用前景。
1.一种phd2敲除的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述phd2敲除的识别位点为：位点1：chr1:231,421,111-231,421,130，位点2：chr1:231,421,134-231,421,153，位点3：chr1:231,421,141-231,421,160。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述phd2敲除的crrna序列为：crrna1的序列如seq id no.1所示，crrna2的序列如seq id no.2所示，crrna3的序列如seq idno.3所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述rnp复合物的制备原料包括：pbs、alt-r guide rna、alt-rcas9酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述pbs、alt-r guide rna、alt-rcas9酶的质量比为(2-2.5)：(1-1.5)：(1.5-2.0)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s3中pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性20sec，35个循环；55℃退火30sec，35个循环；72℃复性30sec，35个循环；72℃延伸5min，1个循环；4℃保存。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述s3中pcr扩增的引物序列如下：引物1-f的序列如seq id no.4所示，引物1-r的序列如seq id no.5所示，引物2-f的序列如seq id no.6所示，引物2-r的序列如seq id no.7所示，引物3-f的序列如seq id no.8所示，引物3-r的序列如seq id no.9所示，引物4-f的序列如seq id no.10所示，引物4-r的序列如seq id no.11所示，引物5-f的序列如seq id no.12所示，引物5-r的序列如seq idno.13所示，引物6-f的序列如seq id no.14所示，引物6-r的序列如seq id no.15所示。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s5中q-pcr实验引物的序列如下：hrplp0-f的序列如seq id no.16所示，hrplp0-r的序列如seq id no.17所示，hvegf-f的序列如seq id no.18所示，hvegf-r的序列如seq id no.19所示。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s5中q-pcr实验的反应程序为：95℃保持2min，1个循环；95℃保持15sec，40个循环；60℃保持1min，40个循环。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s5中q-pcr实验的反应原料包括：qpcr master mix、cdna、引物-f、去离子水，质量比为(9.5-12)：(1-3)：(0.5-1)：(6-8)。
