本发明属于生物，涉及一种靶向tup1基因的dsrna及其在制备治疗或预防尖孢镰刀菌致白术根腐病的制剂中的应用。
背景技术：
1、杭白术(atractylides macrocephala koidz.)为菊科苍术属植物多年生草本，又名浙术，是道地药材“浙八味”之一，素有“十方九用”、“南术北参”之称，具有健脾益气、燥湿利水等作用，临床需求量很大。然而，白术连作障碍，种植地须隔5-10年才能再种，其中根腐病等真菌病是最严重的连作障碍病害，该病的主要病原菌是尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)等菌，导致根茎腐烂，并通过土壤侵染其他植株，使白术死亡。对根腐病的有效防控一直是难点，因致病菌在没有寄主的情况下仍可存活，目前的物理轮作防治和化学防治各有不足，筛选抗病品种又有育性差等限制，这使得生物防治越来越得到重视。
2、small rna(srna)存在于真核生物中，是长度200nt以下的非编码rna分子，主要分为mirna(microrna)和sirna(small interfering rna)两种形式，它可以协调植物生长、发育和逆境响应等多种生物过程，在生物防治中逐渐被开发用于防治作物病虫害。
3、喷雾诱导基因沉默(spray-induced gene silencing，sigs)是基于rna干扰(rnainterference，rnai)，在体外合成双链rna(double-stranded rna，dsrna)并喷洒于植物表面，通过dsrna的跨界转运和对同源信使rna(message rna，mrna)的特异性降解，实现对靶标基因的沉默，从而抑制病害的发生。作为一种新型的植物病害防控技术，sigs已被用于多种植物病害的治理研究，并展示出良好的应用前景，例如：rna喷雾介导的禾谷尖孢镰刀菌ago和dcl基因沉默，可以减少大麦叶上的禾谷尖孢镰刀菌感染，提高大麦抗病性；向寄主植物表面喷洒体外转录的bc-dcl1/2-dsrna，降低灰霉菌srna效应因子bcdcl1和bcdcl2的表达，从而抑制灰霉病的发生；通过敲除靶向抗性基因的srna，在致病菌感染后表现出较轻的症状，芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus，tumv)感染后，油菜的mir1885敲除株与野生型植物相比表现出较轻的症状。
4、迄今为止，基于dsrna对靶标基因的沉默用于防治作物真菌病害的研究主要集中在小麦、玉米、马铃薯等粮食作物上，在白术等药用植物中却未见报道。而在现代分子生物学的快速发展的今天，以及对植物与病原菌互作分子机制的不断深入研究，sigs因其专一性、高效性和环境友好性而备受青睐，具有切实可行的操作性及非常光明的应用前景，将成为未来用于开发新的治疗植物病害控制的新工具。因此，本发明提供一种尖孢镰刀菌tup1毒力基因，公开了一种治疗或预防尖孢镰刀菌致白术根腐病的dsrna制剂的制备方法及其应用，为防治尖孢镰刀菌致白术根腐病提供一种新的方法和思路，更为解决其他中药材的根腐病问题提供了可能。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种以尖孢镰刀菌tup1基因为靶标的dsrna的制备及其应用，体外合成的dsrna通过靶向沉默尖孢镰刀菌tup1基因表达，从而抑制尖孢镰刀菌的侵染，减少白术根腐病患病率，有效解决目前国内外对白术根腐病难以防控的问题，弥补物理防治和化学防治上的不足，为防治尖孢镰刀菌致白术根腐病提供一种新方法和思路，具有非常良好的应用前景。
2、为实现以上目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
3、第一方面，本发明提供一种靶向tup1基因的dsrna，所述tup1基因为seq id no：1所示脱氧核苷酸序列或其经过一个或几个脱氧核苷酸的取代和/或缺失和/或添加仍具有相同功能的基因。
4、本发明的实施例证明，通过抑制尖孢镰刀菌tup1基因即可抑制尖孢镰刀菌的侵染，减少白术根腐病患病率，本发明制备的多种dsrna均有效果。因此，针对该基因的其他抑制该基因的dsrna也在本发明的保护范围内。针对尖孢镰刀菌的其他亚型的tup1基因或其经过一个或几个脱氧核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的同源基因制备的具备抑制功能的dsrna也在本发明的保护范围内。
5、进一步，本发明提供几种dsrna，所述靶向tup1基因的dsrna为下列之一或其反向互补序列：
6、如seq id no：3所示的核苷酸序列、seq id no：4所示的核苷酸序列、seq id no：5所示的核苷酸序列。
7、优选所述靶向tup1基因的dsrna为seq id no：3所示的核苷酸序列。
8、第二方面，本发明提供上述靶向tup1基因的dsrna的制备方法，所述方法为：
9、s1：以尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)基因组dna为模板，以引物对fotup1 f和fotup1 r进行pcr扩增，获得tup1基因片段；
10、fo tup1 f：5’-atgtcgatgtatccgcatcgc-3’
11、fo tup1 r：5’-tgacttcgacagaaccggac-3’
12、s2：以步骤s1所述的tup1基因片段为模板，以下列引物对之一进行pcr扩增，获得转录模板：
13、(1)tup1-1400 primer f：
14、5’-taatacgactcactatagggtctcgttcctcctcagccagg-3’
15、tup1-1400 primer r：
16、5’-taatacgactcactataggggagccagtggcaagtatcttcc-3’
17、(2)tup1-800 primer f：
18、5’-taatacgactcactatagggccttactctcagaactatcctccgg-3’
19、tup1-800 primer r：
20、5’-taatacgactcactataggggacgccatcctctattgtcagag-3’
21、(3)tup1-500 primer f：
22、5’-taatacgactcactatagggctcaagtcagccatccgactcc-3’
23、tup1-500 primer r：
24、5’-taatacgactcactataggggcgagtaaatatcttgctcgtgacc-3’；
25、s3：以t7 rna聚合酶对s2所述的转录模板进行转录，所得转录产物经dnase i和rnase t1进行双酶消化，得到所述靶向tup1基因的dsrna。
26、第三方面，本发明提供上述靶向tup1基因的dsrna在抑制尖孢镰刀菌中的应用。
27、第四方面，本发明还提供上述靶向tup1基因的dsrna在预防或治疗尖孢镰刀菌致白术根腐病中的应用。
28、具体地，所述应用为：将所述靶向tup1基因的dsrna制备成治疗或预防尖孢镰刀菌致白术根腐病的制剂。所述制剂可以以te缓冲液或ddh2o为介质，在本发明的实施例中是ddh2o。更进一步，所述应用的方法为：将所述制剂滴加于植株的病发处或伤口处。
29、在本发明的实施例中，所述植株为生长至二叶期的白术幼苗。
30、尖孢镰刀菌tup1基因，核苷酸序列如seq id no：1所示，氨基酸序列如seq id no：2所示。设计相应的简并引物后，通过pcr扩增获得其保守区，产物经琼脂糖凝胶电泳检测其片段长度为2000bp左右，经测序后，在ncbi数据库中进行blast比对确定其为tup1基因，同时获得其全长为1989bp，有3个内含子，编码591个氨基酸。
31、本发明提供抑制尖孢镰刀菌tup1基因表达的干扰基因片段，根据seq id no：1设计上下游引物经pcr扩增获得。所述干扰基因片段，具有seq id no：3、seq id no：4和seqid no：5所示的核苷酸序列。
32、本发明提供用于扩增所述干扰基因片段的引物组，包括上游引物seq id no：6和下游引物seq id no：7，上游引物seq id no：8和下游引物seq id no：9，以及上游引物seqid no：10和下游引物seq id no：11。
33、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种尖孢镰刀菌tup1基因、抑制尖孢镰刀菌tup1基因表达的干扰基因片段、用于扩增所述基因片段的引物组及尖孢镰刀菌tup1基因的干扰基因片段合成的dsrna在尖孢镰刀菌致白术根腐病防治中的应用，体外合成的dsrna通过靶向沉默尖孢镰刀菌tup1基因的表达，有效抑制尖孢镰刀菌的侵染，减少白术根腐病患病率，从而达到生物防治的目的。因此本发明提供一种尖孢镰刀菌tup1基因及以tup1基因为靶标的dsrna制剂及其应用，可用于防治尖孢镰刀菌致白术根腐病的喷雾杀菌制剂的开发。
1.一种靶向tup1基因的dsrna，其特征在于：所述tup1基因为seq id no：1所示脱氧核苷酸序列或其经过一个或几个脱氧核苷酸的取代和/或缺失和/或添加仍具有相同功能的基因。
2.如权利要求1所述的靶向tup1基因的dsrna，其特征在于：所述靶向tup1基因的dsrna为下列之一或其反向互补序列：
3.如权利要求2所述的靶向tup1基因的dsrna，其特征在于：所述靶向tup1基因的dsrna为seq id no：3所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的靶向tup1基因的dsrna的制备方法，所述方法为：
5.如权利要求1-3任一项所述的靶向tup1基因的dsrna在抑制尖孢镰刀菌中的应用。
6.如权利要求1-3任一项所述的靶向tup1基因的dsrna在预防或治疗尖孢镰刀菌致白术根腐病中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述靶向tup1基因的dsrna制备成治疗或预防尖孢镰刀菌致白术根腐病的制剂。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述制剂的介质为ddh2o。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将所述制剂滴加于植株的病发处或伤口处。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植株为生长至二叶期的白术幼苗。
