本发明属于生物分析及快速检测，具体公开一种羧基聚苯乙烯荧光微球及其制备方法和应用。
背景技术：
1、荧光分析方法具有分析速度快、灵敏度高、结果稳定、定量分析等优势受到临床诊断、食品安全等快速检测领域的研究者们广泛关注，在保障人们生命健康方面发挥着关键作用。荧光微球是一种在外界激发光刺激下发射出荧光的功能微球，在单个微球中富集了成千上万的荧光有机或无机物质，具有荧光微球粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高的优点，在生物化学、医药、临床医学、基因分析以及光学仪器等众多领域都具有广泛的应用。
2、羧基聚苯乙烯荧光微球是一种高分子材料，因其具有较好的稳定性、生物相容性、可调控的粒径和荧光强度而受到广泛关注，经常被应用于血流测定、示踪、体内成像，以及成像仪器和流式细胞仪的校准等方面。近年来，随着科技的不断进步，羧基聚苯乙烯荧光微球的应用领域不断扩大，在生物医药、环境监测、食品安全等领域具有非常可观的应用前景，如癌症早期诊断、药物传递和环境污染物监测。目前，羧基聚苯乙烯荧光微球已成为生物医药、环保、新能源等众多行业的核心材料之一。
3、现有制备羧基聚苯乙烯荧光微球的通常采用的方法是溶胀法，即采用甲苯、氯仿作为溶胀剂将荧光分子引入微球中，但这种方法制得的荧光微球荧光较弱，容易造成种子微球溶解粘连，并且制备过程中对环境污染大。此外，还会造成聚苯乙烯微球出现多孔，荧光分子容易泄露，从而限制了其应用。
4、虽然目前已经有相关技术处理此类问题，但这些技术中仍存在的一定的缺陷，例如cn 114933897a公开了一种溶胀法制备聚集诱导发光微球的方法及其应用，合成的荧光微球具有荧光信号强、染料装载量大，表面具有可以直接用于蛋白质偶联的官能团的优点，但是该制备方法仍存在制备小粒径荧光微球时，不能实现精准控制的缺陷。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种羧基聚苯乙烯荧光微球及其制备方法和应用解决现有制备方法难以实现小粒径荧光的精准控制，从而影响荧光微球的质量、分散性和稳定性等问题。
2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
3、本发明的第一方面提供一种羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，包括以下步骤。
4、s1、将固含量1-2％的羧基聚苯乙烯微球溶液分散在表面活性剂水溶液中制成混悬液，即为水相微球溶液；
5、s2、将荧光分子溶解于有机溶剂中，制成荧光分子有机相溶液；
6、s3、将水相微球溶液和荧光分子有机相溶液在超声微反应器或超声微混合器内混合，并在5-60℃下进行反应，得到样品溶液，其中，所述有水相微球溶液和有机相溶液进入超声微反应器或超声微混合器的流量比为(1-8)：1，可以保证两相溶液在反应器中始终处于等比混合的状态。
7、s4、除去样品溶液中的有机溶剂，得到微球溶液，然后对微球溶液进行筛分，即得到羧基聚苯乙烯荧光微球。
8、本发明提供的羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，通过首次采用超声微反应器或微混合器作为反应器制备荧光微球，超声与微反应器协同作用的超强混合性能，可以将水相微球溶液和荧光分子有机相溶液在反应时混合得更加均匀，使粒径变得均一，并通过精准设置水相和有机相的流速比、总流速、超声功率以及温度控制，来调控混合性能，使微球溶胀反应荧光分子的同时尽可能抑制过程中可能出现的团聚现象，实现精准控制荧光微球粒径、形貌、荧光性质等性能，实现连续制备小粒径、高荧光含量、高分散性和优异稳定性的羧基聚苯乙烯荧光微球。
9、进一步地，在上述羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法中，羧基聚苯乙烯微球溶液的固含量为1-2％，为有助于维持溶液的稳定性，防止高分子物质在溶胀过程中发生沉淀或聚集，更进一步地，所述羧基聚苯乙烯微球溶液的固含量为1％。
10、进一步地，所述水相微球溶液和荧光分子有机相溶液进入超声微反应器或超声微混合器混合时，所述荧光分子和微球的质量比为1:(1-10)。
11、需要说明的是，本发明中步骤s1和s2可以通过预先大量配制；本发明中固含量是指羧基聚苯乙烯微球溶液烘干后羧基聚苯乙烯微球占溶液总量的质量百分数；本发明中的超声微反应器或超声微混合器的微混合结构包括不限于发明人团队已申请的专利202222930543.6、202110770263.0、202121541511.6中所公开的结构以及t型、y型、螺旋型等常见微混合结构。
12、进一步地，在超声微反应器或超声微混合器内混合时，为了避免过高或过长的超声空化使微球的过多溶胀而交联聚集，同时确保有机溶剂与微球的有效接触及均匀溶胀，因此，选择超声频率为10-100khz，超声功率为5-60w，超声时间为1-120s，优选地，所述超声频率为20-40khz，超声功率为30w-50w，超声时间为20-60s。
13、进一步地，为使微球均匀地分散和溶胀，且水溶液占比不会影响超声溶胀时有机溶剂与微球的有效接触，所述步骤s1中的微球溶液与表面活性剂水溶液的质量比为1：(1-2)。
14、进一步地，所述步骤s1中的表面活性剂为sas(十二烷基硫酸钠)、sds(十二烷基磺酸钠)、sdbs(十二烷基苯磺酸钠)中的一种。
15、在本发明中，当表面活性剂质量分数过高时，其对溶液的改性作用过于强烈，可能导致溶胀过程失衡从而难以控制微球形貌，也会使微球表面的亲水基团过多，从而影响微球的溶胀性能和稳定性，因此，所述表面活性剂水溶液中表面活性剂质量分数小于等于1％，优选地，所述表面活性剂质量分数为0.25％。
16、进一步地，所述步骤s2中荧光分子有机相溶液的浓度为10-20mg/ml。
17、进一步地，所述步骤s2中有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳、甲苯、thf中的至少一种，优选为二氯甲烷和三氯甲烷，因二氯甲烷的沸点低、挥发性强，综合溶胀后微球的形貌和性能，以及后期溶剂去除的方便性，二氯甲烷是要优于其他有机溶剂。因此，更优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷。
18、进一步地，所述步骤s2中的荧光物质为脂溶性荧光分子，包含cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7、cy7.5、罗丹明101、罗丹明b、tritc、nbd中的一种。
19、溶胀反应技术是基于溶胀过程中，荧光分子随着有机溶剂进入微球内部，所以相比于水溶性荧光分子，脂溶性荧光分子更容易被包覆，这样有利于提高荧光微球的荧光强度，因此，在本发明中荧光物质选择脂溶性荧光分子。
20、进一步地，所述除去样品溶液中的有机溶剂的方式可采取先用水稀释后再开始蒸发或直接蒸发两种方式。
21、进一步地，为了去除里面少量的因溶胀程度过高或微球粘连产生的大颗粒，以及极少数未能溶胀或溶胀程度过低的微球，需对微球溶液进行筛分，对微球溶液进行筛分时可采用网筛与差速离心两种方式中的一种。
22、本发明的第二方面提供一种上述制备方法制得的羧基聚苯乙烯荧光微球，所述荧光微球的粒径在200-500nm，固含量为0.5-2.0％，更优选为0.7％，分散系数0.02-0.2，荧光强度为500-1000rfu。
23、在很多的细胞或生物的荧光实验中，近似1％的固含量既不会过高也不会过低，可以在很多细胞或生物实验中达到较好的效果，本发明制得的羧基聚苯乙烯荧光微球的固含量0.5-2.0％，更优选为0.7％，满足实验中的要求，且当对于荧光强度要求更低时，也便于根据需要进行稀释，从而达到合适的浓度。此外，适当的固含量可以保证荧光微球试剂的稳定性和活性，从而确保实验结果的可靠性。
24、本发明的第三方面提供一种羧基聚苯乙烯荧光微球的应用，所述荧光微球应用于生物分子或细胞的标记。
25、本发明提供羧基聚苯乙烯荧光微球，粒径小，固含量适中，荧光强度可达500-700rfu，可以在很多细胞或生物实验中达到较好的效果，可应用于很多生物分子或细胞的标记。
26、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
27、(1)本发明提供的羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，基于溶胀法，通过首次采用超声微反应器或微混合器作为反应器制备荧光微球，利用超声与微反应器协同作用的超强混合性能，可以将溶液和有机相溶液在反应时混合得更加均匀，使粒径变得均一，开发出了粒径均一的荧光微球的合成方法，且该方法易于放大，可连续生产。
28、(2)本发明通过精准设置水相和有机相的流速比、总流速、超声功率以及温度控制，来调控混合性能，使微球溶胀反应荧光分子的同时尽可能抑制过程中可能出现的团聚现象，实现精准控制荧光微球粒径、形貌、荧光性质等性能，实现连续制备小粒径、高荧光含量、高分散性和优异稳定性的羧基聚苯乙烯荧光微球。
1.一种羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于，在超声微反应器或超声微混合器内混合时，超声频率为10-100khz，超声功率为5-60w，超声时间为1-120s。
3.根据权利要求1所述的羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中的微球溶液与表面活性剂水溶液的质量比为1：(1-2)。
4.根据权利要求1所述的羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中的表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的一种，所述表面活性剂水溶液中，表面活性剂的质量分数小于等于1％。
5.根据权利要求1所述的羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中荧光分子有机相溶液的浓度为10-20mg/ml。
6.根据权利要求1所述的羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳、甲苯、thf中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的羧基聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中的荧光物质为脂溶性荧光分子，包含cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7、cy7.5、罗丹明101、罗丹明b、tritc、nbd中的一种。
8.一种如权利要求1-7所述的制备方法制得的羧基聚苯乙烯荧光微球，其特征在于，所述荧光微球的粒径在200-500nm，固含量为0.5-2.0％，分散系数0.02-0.2，荧光强度为500-700rfu。
9.一种如权利要求8所述的羧基聚苯乙烯荧光微球的应用，其特征在于，所述荧光微球应用于生物分子或细胞的标记。
