本发明涉及一种半制备高效液相色谱分离纯化虾青素工艺。
背景技术：
1、一般来说，从天然产物直接提取得到的虾青素含有很多杂质，使虾青素的稳定性和生物活性降低(郑覃.黑果枸杞花色苷的提取，纯化及活性组分研究[d].天津商业大学,2018.)，因此需对虾青素的天然提取物进行分离纯化。分离纯化的方法主要有膜分离法、柱层析法、薄层层析法、高效液相色谱法等(崔春雨,刘志平,周敏等.金银花化学成分的研究[j].广西大学学报(自然科学版),2012,37(03):530-533.)。高效液相色谱法(hplc)是一种通过高压泵输送流动相，利用高效固定相的分离能力分离纯化、分析检测样品的手段(温素萍.发酵来源莽草酸分离纯化及质量研究[d].华南理工大学,2020.)。制备型hplc是在分析型hplc的基础上发展起来的一种高效分离纯化技术(吴希,邓勤,徐志勇等.制备型高效液相色谱在天然产物分离中的应用[j].化学分析计量,2017,26(01):113-117+122.)。近十几年来，制备型hplc是天然产物化学研究中应用最普遍、最有效和相关技术发展最快的分离纯化方法(latif z,sarker sd.isolation of natural products by preparative highperformance liquid chromatography(prep-hplc)[j].natural products isolation,2012:255-274.)。朱云霞等利用agilent 1100系列半制备型高效液相色谱对三尖杉总碱进行分离制备，得到4种含量较高的三尖杉生物碱(朱云霞,侯卫,李明等.福建三尖杉中生物碱的高效液相分离与鉴定[j].复旦学报:自然科学版,2004,43(6):1124-1128.)。尹元元等利用日本shimadzu lc-6a高效液相色谱仪，采用ymc c18色谱柱，从吴茱萸中得到11种生物碱类化合物(尹元元,刘珊珊,韩利文等.吴茱萸生物碱类化学成分及其抗血管生成活性分析[j].中国实验方剂学杂志,2016,22(5):45-53.)。制备型高效液相色谱已成为分离制备单体的主流技术(王欣然,齐建平,吴夏青等.制备型高效液相色谱在药物分离纯化中的应用研究进展[j].分析试验室,2014,12.)。但现有的分离工艺或是工艺复杂，成本高，或是分离效率低，有待进一步改进。薄层色谱法纯化虾青素样品量较少，柱层析法操作简单，成本低，分离效果较好，但只能分离极性存在较大差异的游离虾青素、虾青素双酯和虾青素单酯(高岩,邢丽红,孙伟红等.不同来源虾青素提取、纯化及定量检测方法的研究进展[j].食品安全质量检测学报,2020,11(05):1414-1423.)。
2、基于上述问题，申请人对上述问题进行了研究，并产生了本案。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种工艺简单、纯化率高、能够降低成本的半制备高效液相色谱分离纯化虾青素的工艺。
2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、半制备高效液相色谱分离纯化虾青素工艺，包括如下步骤：
4、步骤a，将虾青素油脂加入皂化液进行皂化，皂化后加入二氯甲烷溶剂进行静置分层，取下层液体浓缩至干，用流动相将浓缩后的物质配置成相应的进样浓度，
5、步骤b，采用半制备液相色谱仪进行分离纯化，根据进样溶液各成分的信号峰，分别收集溶液，将收集的溶液置于高效液相色谱仪检测，与虾青素标准品对照，确定虾青素在半制备液相色谱仪的信号位置并收集其信号峰处的溶液，其中，
6、在反相模式下，色谱柱为c18柱，规格为20mm×250mm，粒径为5μm，流动相为甲醇与乙腈混合溶液，检测波长为475nm，所述进样浓度为1.6mg/ml，流速为3.5ml/min，进样体积1.0ml，柱温30℃；
7、在正相模式下，色谱柱为sio2柱，规格为10mm×250mm，粒径为10μm，所述流动相为正己烷与乙酸乙酯混合液，检测波长为475nm，所述进样浓度为1.0mg/ml，流速4.0ml/min，进样体积1.5ml，柱温30℃。
8、作为本发明的优选方式，所述皂化液为3mg/ml的naoh-甲醇溶液，皂化的温度为10℃；反应时间60min。
9、作为本发明的优选方式，所述二氯甲烷溶剂与皂化液的体积比为1:2。
10、作为本发明的优选方式，所述甲醇与乙腈混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为7:3。
11、作为本发明的优选方式，所述正己烷与乙酸乙酯混合液中正己烷与乙酸乙酯体积比为75:25。
12、采用本发明的技术方案后，采用半制备液相色谱仪对虾青素油进行分离纯化，通过选用特定的进样浓度、流速、进样体积以及柱温，操作工艺简单，c18色谱柱纯化后其纯度为96.5％，sio2柱纯化后其纯度为94.5％。通过红外、核磁、质谱分析，确定得出纯化后的物质为虾青素。研究对比，综合考虑成本因素，sio2柱更适用于工业上纯化虾青素。本发明皂化后直接进行分离，简化方法、成本低、效率高。
1.半制备高效液相色谱分离纯化虾青素工艺，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的半制备高效液相色谱分离纯化虾青素工艺，其特征在于，所述皂化液为3mg/ml的naoh-甲醇溶液，皂化的温度为10℃；反应时间60min。
3.如权利要求2所述的半制备高效液相色谱分离纯化虾青素工艺，其特征在于，所述二氯甲烷溶剂与皂化液的体积比为1:2。
4.如权利要求3所述的半制备高效液相色谱分离纯化虾青素工艺，其特征在于，所述甲醇与乙腈混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为7:3。
5.如权利要求3所述的半制备高效液相色谱分离纯化虾青素工艺，其特征在于，所述正己烷与乙酸乙酯混合液中正己烷与乙酸乙酯体积比为75:25。
