本发明属于细胞工程，特别涉及一种高表达的单克隆细胞株筛选方法。
背景技术：
1、传统的采用minipool的常规流程筛选单克隆细胞株的方法包括：表达载体的构建，细胞转染，细胞恢复，迷你细胞池筛选和单细胞筛选。其中，单细胞筛选包括：流式细胞仪筛选单细胞、单细胞拍照溯源，高表达单细胞筛选，高表达单细胞扩增，高表达单细胞fed-batch培养与评估。该筛选方法具有随机性、需要较高的筛选通量，而且通过该方法获得的单克隆细胞株表达量相对较低。因此，亟需找到一种可以高效、特异性筛选出高表达单克隆细胞株的方法。
2、与原始的单细胞筛选技术相比，现在的筛选技术已经有大幅提升，但是仍然都是随机筛选。最原始的单细胞筛选方式是两轮有限稀释，该方法筛选周期长。后来使用clonepix筛选，该技术是基于在半固体培养基中，单个细胞会逐渐形成细胞团的原理筛选，但是由于可能会存在假单细胞源性，被监管机构挑战。最近几年，单细胞拍照设备研发出来后，监管机构逐步认可一轮单细胞筛选加上单细胞拍照验证的单细胞筛选方式。该单细胞筛选方式主要包括一轮有限稀释、单细胞打印机、vips、荧光激活细胞排序技术（facs）、beacon等。尽管这些改进措施对于有限稀释筛选技术的完善起到了积极的作用，但仍然存在目前单细胞筛选具有随机性，需要高通量筛选的问题。
技术实现思路
1、鉴于现有技术的不足，本发明提供一种高表达的单克隆细胞株筛选方法。该方法首次采用定向筛选单细胞取代了传统随机性筛选单细胞，筛选通量减少一半、表达量提高近40%，能够有效提高单细胞筛选效率，获得更高表达量的单细胞株，是一种高效、特异性单细胞构建方法。
2、本发明提供一种高表达的单克隆细胞株筛选方法，包括：用含目的基因和gs基因的外源载体转染宿主细胞，经细胞恢复培养后，于多孔细胞培养板中按一定的铺板密度进行铺板形成迷你细胞池，筛选外源蛋白高表达的迷你细胞池，记为待筛选细胞培养液；将荧光染料alexa fluortm488与蛋氨酸亚氨基代砜混合后，再与所述待筛选细胞培养液混合，得到荧光标记的细胞培养液，经孵育后，离心去上清，将剩余细胞沉淀重悬，得到细胞悬液；将所述细胞悬液依次进行流式细胞仪筛选为单细胞、单细胞拍照、外源蛋白高表达单细胞筛选、单细胞扩增、单细胞分批补料培养与评估，得到单克隆细胞株。
3、谷氨酰胺在细胞的生长和代谢中具有重要作用，谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase, gs）催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，是哺乳动物体内谷氨酰胺形成的唯一途径。蛋氨酸亚氨基代砜（methionine sulfoximine,msx）是gs的竞争性抑制剂，可与谷氨酸竞争性的与gs的活性位点结合，从而抑制gs催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺。
4、发明人惊讶地发现，荧光染料alexa fluortm488能够与蛋氨酸亚氨基代砜结合，这可能与蛋氨酸亚氨基代砜的结构中含有1个-nh2，可以通过-nh2与alexa fluortm488发生特异性的结合有关。而msx是gs的竞争性抑制剂，因此alexa fluortm488和蛋氨酸亚氨基代砜偶联复合物又可以特异性的与gs结合。
5、本发明首次将alexa fluortm488与msx特异性偶联后，进入细胞内再与gs特异性偶联，并应用于单细胞筛选，该方法提高了标记的特异性，实现了对高表达细胞株的定向筛选。利用gs的表达量与目的蛋白的表达量成正相关关系。因此，通过特异性地筛选迷你细胞池中荧光强度高的细胞，最终单克隆的表达量提高近40%，筛选通量减少一半。
6、根据本发明的具体实施方式，荧光标记的细胞培养液中，荧光染料alexafluortm488的浓度为1.1~1.2 mg/ml。
7、根据本发明的具体实施方式，荧光标记的细胞培养液中，蛋氨酸亚氨基代砜的浓度为20~30 μm。
8、根据本发明的具体实施方式，待筛选细胞培养液的细胞密度为0.8~1.2 e6cells/ml。
9、根据本发明的具体实施方式，孵育的温度为18-25 ℃，孵育的时间为24 h。
10、根据本发明的具体实施方式，宿主细胞选自dg44、ns0、chos、chok1、cho-gs ko、hek293细胞中的任意一种。
11、根据本发明的具体实施方式，细胞恢复培养为根据宿主细胞类型，采用适应性的选择培养基培养外源gs基因高表达，内源gs基因不表达的细胞至细胞活率完全恢复。
12、根据本发明的具体实施方式，宿主细胞为敲除gs基因的宿主细胞，选择培养基为不含谷氨酰胺的生长培养基。
13、根据本发明的具体实施方式，生长培养基包括cd cho fusion、dynamis、cd cho、actipro、cho maxc、media c plus中的任意一种。
14、根据本发明的具体实施方式，外源蛋白高表达的迷你细胞池为外源蛋白表达量排名前3的迷你细胞池。
15、本发明的有益效果为：
16、本发明提供的筛选方法，利用荧光染料alexa fluortm488与蛋氨酸亚氨基代砜之间，以及蛋氨酸亚氨基代砜与gs之间可发生特异性偶联，进而使荧光染料alexa fluortm488、蛋氨酸亚氨基代砜与含目的基因和gs基因的宿主细胞混合，形成荧光染料alexafluortm 488/蛋氨酸亚氨基代砜/gs的三元偶联物用于特异性标记gs，利用gs的表达量与目的蛋白的表达量成正相关关系，通过特异性的筛选迷你细胞池中荧光强度高的细胞，即gs表达量高的细胞，进而筛选得到目的蛋白表达量高的细胞。该方法提高了标记的特异性，能够实现对目的蛋白高表达单克隆细胞株的定向筛选，同时显著降低筛选通量，极大地提高了筛选效率。
1.一种单克隆细胞株筛选方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记的细胞培养液中，荧光染料alexa fluortm 488的浓度为1.1~1.2 mg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记的细胞培养液中，蛋氨酸亚氨基代砜的浓度为20~30 μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待筛选细胞培养液的细胞密度为0.8~1.2 e6 cells/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为18-25 ℃，所述孵育的时间为24 h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自dg44、ns0、chos、chok1、cho-gs ko、hek293细胞中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞恢复培养为根据宿主细胞类型，采用适应性的选择培养基培养外源gs基因高表达，内源gs基因不表达的细胞至细胞活率完全恢复。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为敲除gs基因的宿主细胞，所述选择培养基为不含谷氨酰胺的生长培养基。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生长培养基包括cd cho fusion、dynamis、cd cho、actipro、cho maxc、media c plus中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白高表达的迷你细胞池为外源蛋白表达量排名前3的迷你细胞池。
