本发明涉及犁头草中植物环肽的提取，特别涉及一种犁头草中植物环肽提取以及鉴定的方法。
背景技术：
1、植物环肽是一种最常见于堇菜科植物中的防御肽，它一般是由28到37个氨基酸首尾相连组成的一类大环肽。植物环肽的关键特征是含有6个半胱氨酸，组成3对二硫键，并以i-iv、ii-v、iii-vi的方式连接。
2、目前，植物环肽已被分成三个亚家族：莫比乌斯亚家族手镯环肽亚家族(bracelet)，以及胰蛋白酶抑制剂亚家族(squash trypsin inhibitor，squash ti)。
3、植物环肽由于其特殊结构，具有很强的热稳定性，化学稳定性以及耐酶降解能力。植物环肽相较于传统线性多肽结构更稳定，特别是头尾环化稳定了肽的n端和c端，并阻止了外蛋白酶的消化，从而提高了其分子稳定性。这些特殊的特征已经证明增加了它们的半衰期，这对开发口服肽类药物具有重要意义。
4、不仅如此，植物环肽还具有一些抗菌活性，抗肿瘤活性，杀虫活性，溶血活性，抗hiv生物活性，酶抑制活性等生物活性。此外，环肽还可以作为分子支架用于改善药物稳定性等特性，增加用药功能。环肽被开发为药物设计的潜在模板支架——创造一个更稳定并且生物可利用的肽，同时仍然保持其生物活性。药物设计是一个快速发展的领域，其中多肽一直是一个主要的焦点。在这种情况下，环肽具有很大的潜力，使这一领域更有效和多样化。
5、但目前植物环肽的提取以及鉴定非常复杂，不利于植物环肽的发展。
技术实现思路
1、为了至少解决或部分解决上述问题，提供一种犁头草中植物环肽提取以及鉴定的方法，通过转录组测序分析，以及质谱分析方法，发现并鉴定的犁头草中的环肽序列。从而提取出犁头草中具有抗鲍曼不动杆菌活性以及枯草芽孢杆菌活性的植物环肽。
2、为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
3、本发明一种犁头草中植物环肽提取以及鉴定的方法，包括以下步骤：
4、a：犁头草植物的预处理，并使用制备型液相色谱分离纯化粗提物；
5、b：各组分的还原和烷基化，使用质谱测定反应前后分子量变化，分析二硫键的数目；
6、c：酶切和ms/ms测序，结合转录组测序结果，鉴定和表征植物环肽序列。
7、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a的步骤如下：将犁头草切碎，并浸泡在含1％甲酸的50％乙腈水溶液中，过夜提取；随后，使用固相萃取小柱以不同比例的乙腈/水溶液对粗提物进行分馏；然后将各馏分注入半制备型反相高效液相色谱中进一步分离。
8、作为本发明的一种优选技术方案，所述不同比例的乙腈/水溶液为含1％三氟乙酸的20％，30％，50％，80％乙腈水溶液。
9、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤b的步骤如下：对每个色谱峰进行质谱分析，以确定其分子量；然后，对可能含有环肽的组分进行二硫苏糖醇介导的二硫键还原，碘乙酰胺对暴露的巯基进行烷基化处理，防止其二硫键重组；之后，使用质谱测定还原和烷基化后肽的分子量，并计算了两个分子量值之间的差值，以确认环肽的存在。
10、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤c如下：对犁头草进行转录组测序，并同时使用blast挖掘犁头草中可能存在的植物环肽序列，对提取到的植物环肽进行胰蛋白酶降解，结合转录组测序结果，鉴定植物环肽的序列信息。
11、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
12、本发明结合转录组与质谱分析，对犁头草提取物进行分离分析，发现粗提物中含有植物环肽，将其提纯并进行序列分析，随后进行抗菌活性分析和细胞毒性研究，最终，从犁头草中提取到了具有抗鲍曼不动杆菌活性和枯草芽孢杆菌活性以及细胞毒性的植物环肽。为植物环肽的发展做出了一定贡献。
1.一种犁头草中植物环肽提取以及鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种犁头草中植物环肽提取以及鉴定的方法，其特征在于，所述步骤a的步骤如下：将犁头草切碎，并浸泡在含1％甲酸的50％乙腈水溶液中，过夜搅拌提取；随后，使用固相萃取小柱以不同比例的乙腈/水溶液对粗提物进行分馏；然后将各馏分注入半制备型反相高效液相色谱中进一步分离。
3.根据权利要求2所述的一种犁头草中植物环肽提取以及鉴定的方法，其特征在于，所述不同比例的乙腈/水溶液为含1％三氟乙酸的20％，30％，50％，80％乙腈水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种犁头草中植物环肽提取以及鉴定的方法，其特征在于，所述步骤b的步骤如下：对每个色谱峰进行质谱分析，以确定其分子量；然后，对可能含有环肽的组分进行二硫苏糖醇介导的二硫键还原，碘乙酰胺对暴露的巯基进行烷基化处理，防止其二硫键重组；之后，使用质谱测定还原和烷基化后肽的分子量，并计算了两个分子量值之间的差值，以确认环肽的存在。
5.根据权利要求1所述的一种犁头草中植物环肽的提取以及鉴定的方法，其特征在于，所述步骤c如下：对犁头草进行转录组测序，并同时使用blast挖掘犁头草中可能存在的植物环肽序列，对提取到的植物环肽进行胰蛋白酶降解，结合转录组测序结果，鉴定植物环肽的序列信息。
