本发明涉及基因工程，尤其涉及一种基于ibbhlh49蛋白的植物经济性状的调控方法。
背景技术：
1、淀粉是植物进行光合作用的重要产物，是植物中含量最丰富、分布最广泛的碳水化合物，不仅是人类日常饮食中的主要能量来源，也是主要的饲料来源，同时作为工业生产的重要原材料，被广泛应用于酿酒、纺织、造纸以及化工等领域。淀粉主要存在于植物的种子、块根、块茎以及果实中，不同作物的淀粉含量各不相同。
2、甘薯(ipomoea batatas)块根中含有丰富的淀粉，其利用价值非常巨大。甘薯作为一种边际土地作物，在不与主粮争地的前提下，其种植面积会有进一步缩小的趋势。因此，利用基因工程培育高产高淀粉的甘薯品种是一种行之有效的手段。然而，甘薯块根中淀粉合成的转录调控机制目前仍然未知。
3、如何挖掘甘薯块根中与淀粉合成的相关基因，深入研究淀粉合成机制，结合植物基因工程对植物淀粉产量进行调控具有重要的意义。
技术实现思路
1、本发明提供一种基于ibbhlh49蛋白的植物经济性状的调控方法，用以调控植物的经济性状，包括块根大小、块根产量、淀粉产量、支链淀粉比例中的至少一种。
2、第一方面，本发明提供一种植物经济性状的调控方法，包括：调控出发植株中ibbhlh49蛋白编码基因的表达，得到转基因植株，所述转基因植株的经济性状与出发植株不同，所述经济性状包括块根大小、块根产量、淀粉产量、支链淀粉比例中的至少一种；
3、所述ibbhlh49蛋白是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：
4、a1)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质；
5、a2)将seq id no:1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物淀粉合成相关的蛋白质；
6、a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白。
7、上述方法中，所述ibbhlh49蛋白来源于甘薯(ipomoea batatas)。
8、上述方法中，seq id no:1所示的蛋白质由521个残基组成，具体氨基酸序列如下所示：
9、mdkggkdeamaakrgddamsfqsanvssewqmngsnlantpigmipnsnpmmvdafclnvwdqsassaslgfcdanvhsnvttsspfgagtsgfttalrggvdrglgmawhpantmlktgmllptapavvppnlpqfpadsdflqraarfscfsggnlgdmmnpfeslspycrgitptqrpqqvfvgnglkpapageisngaadgsplnnnsvieyavgsrnsakegggafgnepnepecssrggldvsegagaessaskkrkrsgqdaetdqnkgtpppaeaatdqtdnqqkgdqnvtatpskpggkggkqgsqasdnpkedyihirarrgqatnshslaervrrekisermkflqdlvpgcnkvtgkavmldeiinyvqslqrqveflsmklatvnprlefnidsllakdilqsragssssllsfphdmtmpyppvhhppstliqaglpslgssadairrtinphlatasgsfkeptpqvpsmwddelhnvvqmgfnpsapldsqdigslppghmksep
10、上述方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
11、上述方法中，所述80％以上的同一性可以为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
12、上述方法中，蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
13、上述方法中，所述调控可以为上调或增强或提高，也可为下调或抑制或降低。
14、进一步地，上调或增强或提高ibbhlh49蛋白编码基因的表达具体包括方法m1)：
15、m1)向出发植株中导入所述ibbhlh49蛋白的编码基因，上调或增强或提高所述ibbhlh49蛋白编码基因的表达，得到转基因植株；相比出发植株，所述转基因植株的块根大小、块根产量、淀粉产量、支链淀粉比例均高于出发植株。
16、上述方法m1)中，所述ibbhlh49蛋白的编码基因为b1)、b2)中的一种；
17、b1)核苷酸序列如seq id no:2所示的核酸分子；
18、b2)与seq id no:2所示的dna分子具有80％以上的同一性，且编码ibbhlh49蛋白的dna分子。
19、seq id no:2所示的核酸分子的核苷酸序列如下所示：
20、atggataagggtggcaaggatgaggccatggcagcaaagagaggtgatgatgctatgagctttcagtcagcaaatgtgtcatctgagtggcaaatgaatggttccaatctcgcgaatacgcctattggaatgattcccaatagcaatccgatgatggtggatgcgttttgcctgaatgtttgggaccaatctgcaagttcagcaagcttaggcttttgtgatgctaatgttcatagcaatgttaccacttctagcccatttggagctggaacaagtgggttcaccaccgccttaagaggcggtgtcgatagaggtcttggtatggcgtggcatccagctaacacgatgttgaaaacggggatgcttctgcctactgctcctgcagtggttcctccgaacttgcctcagttcccagctgattccgattttcttcaaagggcagcgaggttttcgtgcttcagtggaggaaacttgggcgatatgatgaacccctttgagtctctgagtccttattgtagaggcataacgccaactcaaaggcctcaacaggtgtttgtaggtaatggactaaaacctgcacccgcgggtgaaatctcaaacggggctgctgatggtagcccgctaaataacaatagcgtgattgaatatgccgttggatctagaaatagtgcaaaagaaggcggaggagcctttggaaatgaacctaacgagcccgaatgtagtagccgtggtggccttgatgtatcagagggtgcaggggcagagtcttctgcctcaaagaaaaggaaaagaagtgggcaggacgctgaaaccgatcaaaacaagggaactccaccaccagctgaagcagcaacagatcagactgataaccagcagaaaggagatcaaaacgtgaccgcaactcccagcaagccaggtggtaaaggcggtaagcaggggtcccaagcttcagataatcctaaagaagattacatccacattcgggctaggagaggccaggccacgaatagccacagtcttgcagaaagagttagaagggagaaaatcagtgaaagaatgaagtttcttcaggatctcgtgcccggttgtaacaaggtcactggcaaagcagtaatgcttgatgaaatcattaattatgtacagtcactccaacgacaggttgagttcttgtcgatgaagcttgcaacagtaaacccacggctcgagttcaacattgatagtctcctagcaaaagatatcctccagtccagggctggctcttcgtcttctctgttgtcttttccacatgatatgactatgccttatccaccagtacaccatccaccatcaacgctgattcaagcaggtcttcctagcctgggaagttctgcagatgcaatacgaagaaccatcaacccgcacttggcaactgcgagtgggagcttcaaggagcctacacctcaggtacctagtatgtgggacgatgagctccataacgttgtccaaatgggcttcaatccaagcgctcccctcgacagccaagatataggttctctaccaccaggccatatgaaatctgagccctga
21、上述方法m1)中，所述80％以上的同一性可以为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
22、上述方法m1)中，通过构建含有ibbhlh49蛋白的编码基因的重组表达载体，并导入出发植株中，以上调或增强或提高ibbhlh49蛋白编码基因的表达。进一步地，所述含有ibbhlh49蛋白的编码基因的重组表达载体可以为pcambia1300-ibbhlh49-gfp。具体地，pcambia1300-ibbhlh49-gfp为利用限制性内切酶kpni和bamhi将ibbhlh49蛋白的编码基因插入至pcambia1300-gfp载体得到的。重组表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
23、上述方法中，下调/抑制/降低ibbhlh49蛋白编码基因的表达具体包括方法m2)：
24、m2)通过基因敲除或基因沉默的方法，下调或抑制或降低所述ibbhlh49蛋白编码基因表达，得到所述转基因植株。
25、上述方法m2)中，所述基因敲除(gene knockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。
26、所述基因沉默(gene silencing)是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。
27、进一步地，本发明通过构建shrna载体发挥rnai功能，以降低ibbhlh49蛋白编码基因的表达水平，具体地，所述shrna的一条链的序列为核苷酸序列如seq idno:2的第1-200位的dna片段转录得到的序列。进一步地，通过构建含有式(i)所示的dna分子的重组表达载体，表达上述shrna后下调或抑制或降低所述ibbhlh49蛋白编码基因表达，得到所述转基因植株：
28、seq反向-x-seq正向(i)；
29、所述seq正向的序列是序列表中seq id no:2所示序列的第1位-第200位；所述seq反向的序列与所述seq正向的序列反向互补；所述x是所述seq正向与所述seq反向之间的间隔序列，所述x与所述seq正向及所述seq反向均不互补。
30、下调或抑制或降低所述ibbhlh49蛋白编码基因表达所获得的转基因植株，其块根大小、块根产量、淀粉产量、支链淀粉比例均低于出发植株。
31、上述方法中，所述植物为如下任一种：
32、d1)双子叶植物；
33、d2)管状花目植物；
34、d3)旋花科植物；
35、d4)番薯属植物；
36、d5)甘薯。
37、可以理解的是，扩增上述ibbhlh49蛋白编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
38、第二方面，本发明提供上述任一所述的ibbhlh49蛋白和/或调控ibbhlh49蛋白编码基因的表达的物质在如下任一方面的应用：
39、d1)调控植物块根大小中的应用；
40、d2)调控植物块根产量中的应用；
41、d3)调控植物淀粉含量中的应用；
42、d4)调控植物支链淀粉比例中的应用；
43、d5)调控植物中淀粉合成相关酶活性中的应用；
44、d6)在植物育种中的应用；
45、d7)制备调控植物淀粉含量的产品中的应用。
46、上述应用中，所述植物育种的目的可以为培育经济性状改变的植物，例如，培育淀粉含量提高或者淀粉含量降低的植物、培育块根大小和/或块根产量改变的植物、支链淀粉比例改变的植物。植物育种中的应用具体可为将含有ibbhlh49蛋白或蛋白质的编码基因ibbhlh49的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。
47、上述应用中，调控所述ibbhlh49蛋白含量或活性的物质为与所述ibbhlh49蛋白相关的生物材料；
48、所述生物材料为下述b1)-b10)中的任一种：
49、b1)编码所述ibbhlh49蛋白的核酸分子；
50、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官；
51、b3)下调或抑制或降低所述ibbzip11蛋白的编码基因的表达的rna分子；
52、b4)转录b3)所述rna分子的编码基因；
53、b5)含有b4)所述编码基因的表达盒；
54、b6)含有b4)所述编码基因的重组载体、或含有b5)所述表达盒的重组载体；
55、b7)含有b4)所述编码基因的重组微生物、或含有b5)所述表达盒的重组微生物、或含有b6)所述重组载体的重组微生物；
56、b8)含有b4)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有b5)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b6)所述重组载体的转基因植物细胞系；
57、b9)含有b4)所述编码基因的转基因植物组织、或含有b5)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b6)所述重组载体的转基因植物组织；
58、b10)含有b4)所述编码基因的转基因植物器官、或含有b5)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b6)所述重组载体的转基因植物器官。
59、上述应用中，b1)所述的编码所述ibbhlh49蛋白的核酸分子可以为b1)核苷酸序列如seq id no:2所示的核酸分子，或者b2)与seq id no:2所示的dna分子具有80％以上的同一性，且编码ibbhlh49蛋白的dna分子。
60、上述应用中，b3)中抑制或降低所述ibbzip11蛋白的编码基因的表达的rna分子为由如式(i)所示的dna分子转录得到的rna：
61、seq反向-x-seq正向(i)；
62、所述seq正向的序列是序列表中seq id no:2所示序列的第1位-第200位；所述seq反向的序列与所述seq正向的序列反向互补；所述x是所述seq正向与所述seq反向之间的间隔序列，所述x与所述seq正向及所述seq反向均不互补。
63、上述应用中，b4)所述的核酸分子为式(i)所示的dna分子；
64、seq反向-x-seq正向(i)；
65、所述seq正向的序列是序列表中seq id no:2所示序列的第1位-第200位；所述seq反向的序列与所述seq正向的序列反向互补；所述x是所述seq正向与所述seq反向之间的间隔序列，所述x与所述seq正向及所述seq反向均不互补。
66、上述应用中，b2)或b5)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达ibbhlh49蛋白的dna分子或者能够转录b3)所述的rna的dna分子，该dna分子不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步地，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap"，chao等人(1999)plant physiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4：3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313：810；rosenberg等人(1987)gene，56：125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet，262：141；proudfoot(1991)cell，64：671；sanfacon等人genesdev.，5：141；mogen等人(1990)plant cell，2：1261；munroe等人(1990)gene，91：151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17：7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.，15：9627)。
67、上述应用中，b2)或b6)所述的重组载体中包括b1)或b3)所述编码基因表达盒。进一步地，可用植物表达载体构建含有所述编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1300、pcambia1300-gfp、pcambia1302、pcambia2300、pcambia2301、pcambia1301、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用ibbhlh49构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
68、为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
69、进一步地，b2)或b6)所述的重组载体可以为pcambia1300-ibbhlh49-gfp和pcambia1300-ibbhlh49-35si-x。重组载体pcambia1300-ibbhlh49-gfp的构建过程如下：(1)用限制性内切酶kpni和bamhi双酶切载体pcambia1300-gfp得到载体骨架；(2)用序列表中如seq id no:2所示的dna分子替换pcambia1300-gfp的限制性内切酶kpni和bamhi识别序列间的片段得到的重组质粒pcambia1300-ibbhlh49-gfp，重组载体pcambia1300-ibbhlh49-gfp表达序列表中seq id no:1所示的ibbhlh49蛋白。重组载体pcambia1300-ibbhlh49-35si-x的构建过程如下：(1)用限制性内切酶bamh i和sali双酶切载体pcambia1300-35si-x得到载体骨架；(2)用序列表中seq id no:2中的第1-200bp所示的dna分子替换pcambia1300-35si-x的限制性内切酶bamhi和sali识别序列间的片段；(3)用序列表中seq id no:2中的第1-200bp所示的dna分子的反向互补序列替换pcambia1300-35si-x的限制性内切酶kpni和saci识别序列间的片段得到的重组载体pcambia1300-ibbhlh49-35si-x，重组载体pcambia1300-ibbhlh49-35si-x含有式(i)所示的dna分子。
70、上述应用中，b2)或b7)所述的重组微生物可以为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)。所述根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌eha105。
71、上述应用中，所述重组微生物具体可以为eha105/pcambia1300-ibbhlh49-gfp、eha105/pcambia1300-ibbhlh49-35si-x。eha105/pcambia1300-ibbhlh49-gfp是将重组质粒pcambia1300-ibbhlh49-gfp转化根癌农杆菌eha105得到的重组农杆菌；eha105/pcambia1300-ibbhlh49-35si-x是将重组质粒pcambia1300-ibbhlh49-35si-x转化根癌农杆菌eha105得到的重组农杆菌。
72、上述应用中，b2)或b9)所述的转基因植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
73、上述应用中，b2)或b10)所述的转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
74、第三方面，本发明提供上述任一所述的ibbhlh49蛋白相关的生物材料。
75、第四方面，本发明提供一种培育转基因植株的方法，包括：调控出发植株中ibbhlh49蛋白编码基因的表达，得到转基因植株，所述转基因植株的块根大小、块根产量、淀粉产量、支链淀粉比例中的至少一项与出发植株不同。
76、本发明提供一种ibbhlh49蛋白、编码基因的目前未知的功能及其用途，通过调控该ibbhlh49蛋白在甘薯中的含量或表达得到转ibbhlh49基因的甘薯植株，经实验表明，相比野生型甘薯植株，过表达ibbhlh49基因的甘薯植株具有更大的块根大小和更高的块根产量，且有关淀粉合成的相关酶的表达量增高，淀粉含量以及支链淀粉比例提高；而干扰表达ibbhlh49基因的甘薯植株具有更小的块根大小和更低的块根产量，且有关淀粉合成的相关酶的表达量降低，淀粉含量以及支链淀粉比例降低；说明ibbhlh49蛋白及编码基因对调控植物经济性状起着重要的作用。本发明所提供的ibbhlh49蛋白及其编码基因在植物经济性状中具有重要的应用价值，在农业领域具有一定的应用空间和市场前景。
1.一种植物经济性状的调控方法，其特征在于，包括：调控出发植株中ibbhlh49蛋白编码基因的表达，得到转基因植株，所述转基因植株的经济性状与出发植株不同，所述经济性状包括块根大小、块根产量、淀粉产量、支链淀粉比例中的至少一种；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控为上调或增强或提高，或者为下调或抑制或降低。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述调控方法包括m1)或m2)：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，m1)中，所述ibbhlh49蛋白的编码基因为b1)、b2)中的一种；
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，m2)中，通过向出发植株中导入式(i)所示的dna分子，下调或抑制或降低所述ibbhlh49蛋白编码基因表达，得到所述转基因植株；
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物为如下任一种：
7.权利要求1-6任一项所述的ibbhlh49蛋白和/或调控ibbhlh49蛋白编码基因的表达的物质在如下任一方面的应用：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，调控ibbhlh49蛋白编码基因的表达的物质为与所述ibbhlh49蛋白相关的生物材料；
9.权利要求9所述ibbhlh49蛋白相关的生物材料。
10.一种培育转基因植株的方法，其特征在于，包括：调控出发植株中权利要求1所述的ibbhlh49蛋白编码基因的表达，得到转基因植株，所述转基因植株的块根大小、块根产量、淀粉产量、支链淀粉比例中的至少一项与出发植株不同。
