本技术涉及动物模型构建，具体涉及一种可实现条件特异遗传校正唐氏综合征小鼠模型的构建方法及应用。
背景技术：
1、唐氏综合征(down syndrome,ds)，又称21三体(trisomy 21)，因人类21号染色体(hsa21)三倍体致病，自然发病率高达1/400-1/2000。虽然普遍推行了产前唐氏筛查及教育，但因现有筛查技术缺陷，个体知识与经济水平限制，近年来社会快速发展致高龄产妇增加，个人选择等各种现实原因，每年仍有数万ds患儿出生。ds累及全身多个系统，患者平均预期寿命随着医疗技术的发展已得到显著提高，然而包括困扰患者和其家庭最突出的智力发育障碍在内，很多临床症状目前仍缺乏有效干预手段，给患儿家庭及社会造成严重的身心负担和经济损失。为研发能有效改善ds患儿智力发育障碍等的治疗方法，需深入了解ds各种临床症状发生的具体分子机制。
2、hsa21含200多个蛋白编码基因和5个已知的mirna基因。基于临床发现的部分21三体病例和小鼠模型的研究认为存在一个或多个主效基因，其三倍体是导致ds某一特定疾病表型的充分或必要条件。但是以智力发育障碍为例，尽管我们及他人通过遗传研究手段已发现鉴定出一些位于hsa21致智力发育障碍的关键致病基因，如dyrk1a、app、rcan1、ifnar等，但一方面这些基因在神经系统多种细胞类型中表达显著增加，其拷贝数变异具体如何引起ds智力发育障碍仍有待解答，另一方面我们也观察到21三体基因间存在复杂的相互作用，一些基因存在相互代偿，多个关键致病基因同时干预反而抵消了单基因独立校正的改善效果。现有技术体系在解析ds多基因多细胞互作上存在较大的局限性。
3、此外，21三体贯穿个体发育全生命周期，其导致的发育异常起始于胚胎期，但一些特征表型如神经系统功能异常一般在出生时并不明显，随年龄增长而加重，结合我国实际的临床干预需求情况，出生后进行遗传干预是否还能对如智力发育障碍等临床症状起到改善作用？仍待研究解答。
技术实现思路
1、基于此，本技术一实施例有必要提供一种可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型，通过调控cre重组酶的时空特异表达，在目标组织细胞中实现遗传校正，实现体内精准调控21三体细胞与正常细胞共存，以解析21三体对特定组织细胞的直接和间接作用，为靶向特定组织细胞异常以改善ds相应临床症状的治疗策略提供理论依据和体内研究数据；或在特定发育阶段进行遗传校正，解析21三体基因在不同发育阶段的作用，为出生后遗传干预治疗效果进行概念验证。
2、技术方案如下：
3、本技术第一方面提供了一种可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
4、通过crispr/cas9或同源重组技术在小鼠16号染色体的人21号染色体同源区末端zbtb21基因的远着丝粒端插入loxp片段，获得zbtb21-loxp/+f0代小鼠；
5、将所述zbtb21-loxp/+f0代小鼠与野生型小鼠杂交，筛选出zbtb21-loxp/+f1代小鼠；
6、将所述zbtb21-loxp/+f1代小鼠与唐氏综合征模型dp16/+小鼠杂交，获得dp16/zbtb21-loxp双阳性小鼠；其中，dp16/+小鼠含与人21号染色体长臂线性同源染色体大片段重复，其重复染色体片段连接处含有一个loxp片段；所述dp16/zbtb21-loxp双阳性小鼠含两个loxp片段，分别位于来自亲本的两条同源染色体上；以及，
7、将所述dp16/zbtb21-loxp双阳性小鼠与野生型小鼠杂交，筛选出dp16；zbtb21-loxp/+双阳性小鼠，即为可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型；其中，所述dp16；zbtb21-loxp/+双阳性小鼠含两个loxp片段，分别位于同一条染色体的重复染色体区段中间和远着丝粒末端。
8、在其中一个实施例中，将打靶载体、grna和cas9注射至小鼠受精卵细胞中，并将受精卵移植到假孕小鼠中，从生产的幼鼠中筛选获得所述zbtb21-loxp/+f0代小鼠。
9、在其中一个实施例中，所述打靶载体依次含有5’同源臂、所述loxp片段及sa-ires-tdtomato-bgpa区段、3’同源臂。
10、可选地，所述5’同源臂如seq id no:2中的第663位碱基至第2448位碱基所示；所述loxp片段如seq id no:2中的第2449位碱基至第2482位碱基所示；所述sa-ires-tdtomato-bgpa区段如seq id no:2中的第2483位碱基至第5092位碱基所示；所述3’同源臂如seq id no:2中的第5093位碱基至第6893位碱基所示。
11、可选地，所述grna的识别区域包括如seq id no:1所示的区域。
12、在其中一个实施例中，所述cas9包括cas9 mrna。
13、在其中一个实施例中，还包括对所述zbtb21-loxp/+f0代小鼠、所述zbtb21-loxp/+f1代小鼠、所述dp16/zbtb21-loxp双阳性小鼠和所述dp16；zbtb21-loxp/+双阳性小鼠进行基因型鉴定的步骤。
14、在其中一个实施例中，所述基因型鉴定方法包括pcr法、测序法和southern blot法中的一种或多种。
15、在其中一个实施例中，采用pcr法对所述zbtb21-loxp/+f0代小鼠进行基因型鉴定，所述基因型鉴定的pcr引物包括如seq id no:3～seq id no:4所示的引物对和/或如seq id no:5～seq id no:6所示的引物对。
16、在其中一个实施例中，采用测序法对所述zbtb21-loxp/+f0代小鼠进行基因型鉴定，所述基因型鉴定的测序引物包括如seq id no:7-seq id no:8所示的引物对。
17、在其中一个实施例中，采用pcr法对所述dp16/zbtp21-loxp双阳性小鼠和dp16；zbtb21-loxp/+双阳性小鼠进行基因型鉴定，所述基因型鉴定的pcr引物包括seq id no:9～seq id no:10所示的引物对和seq id no:7及seq id no:11所示的引物对。
18、本技术第二方面提供了采用所述的构建方法构建得到的可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型的细胞或组织。
19、本技术第三方面提供了所述的构建方法构建得到的可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型在构建条件遗传校正唐氏综合征小鼠模型中的应用。
20、本技术第四方面提供了一种实现唐氏综合征小鼠模型的条件遗传校正的方法，包括如下步骤：
21、采用所述的构建方法构建可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型；以及，
22、采用细胞谱系特异表达cre小鼠与所述唐氏综合征小鼠模型杂交，或者
23、向所述唐氏综合征小鼠模型中注射含cre的aav载体，实现唐氏综合征小鼠模型特定组织及细胞或特定发育阶段的条件遗传校正。
24、在其中一个实施例中，还包括对条件遗传校正的特定组织和细胞进行遗传鉴定。
25、在其中一个实施例中，采用pcr法对条件遗传校正的特定组织和细胞进行遗传鉴定，所述基因型鉴定的pcr引物包括seq id no:11～seq id no:12所示的引物对。
26、相对于传统技术，本技术具备如下有益效果：
27、本技术利用crispr/cas9或同源重组技术以及dp16/+小鼠构建过程中遗留于重复染色体片段交界处的loxp位点，创新性建立一种可在目标细胞类型中或特定发育阶段完全校正ds遗传缺陷的研究模型，该模型与各种组织特异性靶点插入cre基因的工具鼠进行杂交，可实现目标组织细胞中完全校正ds遗传缺陷，可以在体内水平揭示ds各系统组织和细胞类型间的互作关系，以研究关键的病理驱动因素，找到干预靶标等；或通过向该模型中aav注射导入cre，用于测试在特定发育阶段利用特定aav血清型进行基因治疗干预的疗效。
1.一种可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将打靶载体、grna和cas9注射至小鼠受精卵细胞中，并将受精卵移植到假孕小鼠中，从生产的幼鼠中筛选获得所述zbtb21-loxp/+f0代小鼠；
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述cas9包括cas9 mrna。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，还包括对所述zbtb21-loxp/+f0代小鼠、所述zbtb21-loxp/+f1代小鼠、所述dp16/zbtb21-loxp双阳性小鼠和所述dp16；zbtb21-loxp/+双阳性小鼠进行基因型鉴定的步骤。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述基因型鉴定方法包括pcr法、测序法和southern blot法中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，采用pcr法对所述zbtb21-loxp/+f0代小鼠进行基因型鉴定，所述基因型鉴定的pcr引物包括如seq id no:3～seq id no:4所示的引物对，和/或如seq id no:5～seq id no:6所示的引物对；
7.采用权利要求1-6任一项所述的构建方法构建得到的可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型的细胞或组织。
8.权利要求1-6任一项所述的构建方法构建得到的可实现条件遗传校正的唐氏综合征小鼠模型在构建条件遗传校正唐氏综合征小鼠模型中的应用。
9.一种实现唐氏综合征小鼠模型的条件遗传校正的方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括对条件遗传校正的特定组织及细胞进行遗传鉴定；
