本发明属于微生物检验，具体涉及用于检测空肠弯曲菌的种特异性分子靶标yclq、crrna、crispr/cas12a体系、检测方法及试剂盒。
背景技术：
1、空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)，是一种革兰氏阴性菌，微需氧的人畜共患病菌，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因之一，同时，部分菌株甚至会带来严重的后遗症：格林-巴利综合征。在食品中，空肠弯曲菌对肉及肉制品污染率相对较高，其中，禽肉被污染率最高。有研究发现空肠弯曲菌在肉鸡盲肠的定殖高达2.55×108cfu/g，在其屠宰加工过程中肠道内容物极易造成禽类食品的污染，人类食用被污染的禽类食品是感染空肠弯曲菌最主要的方式。弯曲菌病的患病率较高，在欧盟和美国，弯曲菌病都是最常见的人兽共患病，高于沙门氏菌。因此，快速检测出食品中空肠弯曲菌的污染情况，对于食品安全意义重大。
2、目前空肠弯曲菌利用国标gb 4789.9-2014进行检测和鉴定，这种方法结果较为准确，但操作复杂(预增菌、选择性培养、显色培养和生化鉴定等)，成本较高，且鉴定结果需要8天甚至更长的时间，这对于食品安全风险的控制极为不利，特别是对即食食品。而以核酸为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。而对现有技术的文献检索，一般使用保守的管家基因如：hipo、16srdna和mapa作为检测基因，但其灵敏度不高，部分靶标的特异性不强。随着全基因组技术的发展，利用泛基因组及全基因组关联分析，可以分析表型和基因之间的关系。同样不同种属的分类也是表型的一种，可以利用全基因组关联分析筛选出种属特异性靶标。基于cas12a蛋白开发的crispr-cas(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats，crispr-associated proteins)检测系统，是一种新型检测方法。利用cas12a蛋白在crrna的引导下，识别匹配的目标序列后就会启动无差别的序列切割活性，从而能够发挥信号增强的作用。基于常规的pcr或者raa扩增目标后，利用crispr/cas12a对信号增强，也避免了凝胶电泳这一步骤，在简单的蓝光灯下，就可以进行裸眼观察，不需要复杂的仪器设备。
技术实现思路
1、本发明旨在针对现有技术中空肠弯曲菌检测所需时间过长，检测成本过高，操作复杂，检测灵敏度低、检测靶标少等问题，提供用于鉴别空肠弯曲菌的特异性检测靶标及其相应的试剂盒和检测方法。
2、为实现上述目的，本发明采用技术方案如下：
3、一种用于检测空肠弯曲菌种特异性分子靶标yclq，所述分子检测靶标为dna片段，所述分子检测靶标编码如seq id no.1所示的核苷酸序列。
4、本发明还提供一种用于检测空肠弯曲菌的pcr/raa引物，所述pcr/raa引物包括核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物。
5、本发明还提供一种用于检测空肠弯曲菌的试剂盒，所述试剂盒包括pcr/raa引物、pcr扩增反应mix1、raa扩增反应mix2、crrna、10×buffer、荧光报告探针和cas12a酶。
6、进一步地，所述的荧光报告探针为holmes ssrna reporter(fam)，其组成为fam-ttttt-bhq1。
7、进一步地，所述crispr/cas12a系统利用cas12a和crrna进行crispr检测，所述crrna以所述靶标位点为靶序列进行设计。
8、所述crrna的设计原则为：在选取crrna靶向序列时，靶向序列5’应具有5’-tttn-3’序列，且crrna序列本身与靶向序列以及引物不形成稳定的二级结构。所述的crrna序列如seq id no.4所示的序列。
9、本发明还提供一种利用嵌合荧光法的qpcr检测试剂盒，所述试剂盒包括qpcr引物、嵌合荧光法qpcr mix和阳性对照dna，qpcr引物的正向引物序列如seq id no.2所示，反向引物序列如seq id no.3所示。
10、本发明还提供一种利用探针法的qpcr检测试剂盒，所述试剂盒包括qpcr引物、荧光探针、探针法qpcr mix和阳性对照dna，qpcr引物的正向引物序列如seq id no.7所示，反向引物序列如seq id no.8所示，荧光探针的核苷酸序列如seq id no.9所示，探针的5’端修饰vic，3’端修饰tamra。
11、本发明还提供上述的特异性分子靶标yclq、pcr/raa引物或试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的检测空肠弯曲菌中的应用。
12、本发明还提供一种非疾病诊断和治疗目的的空肠弯曲菌检测方法，包括以下步骤：
13、(a)提取待测样品基因组dna；
14、(b)以基因组dna为模版，应用pcr/raa引物进行pcr/raa扩增，得到扩增产物；
15、(c)将扩增产物加入到含有crrna、荧光报告探针、10×buffer和cas12a酶的反应体系中，进行crispr/cas12a反应；
16、(d)通过荧光检测仪器或蓝光仪确定检测结果。
17、优选地，步骤(b)中，所述pcr扩增反应体系为10μl，其中包括：mix1 5μl，正向和反向引物各0.25μl，dna模板0.5μl，无菌双蒸水4μl。
18、优选地，pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
19、优选地，步骤(b)中，所述raa扩增反应体系为12.5μl，其中包括：mix2 6.25μl，正向和反向引物各0.75μl，dna模板1μl，无菌双蒸水2.5μl，乙酸镁1.25μl。
20、优选地，raa反应条件为：37℃20min。
21、优选地，步骤(c)中，所述crispr/cas12a反应体系为10μl，其中包括：0.4μl荧光报告探针(holmes ssrna reporter)，0.1μl cas12a蛋白，0.1μl crrna，1μl 10×buffer，1μlpcr或raa扩增产物，使用ddh2o补充至10μl。
22、优选地，所述crispr/cas12a反应条件为：37℃反应20-30min。
23、本发明具有以下有益效果：本发明是基于全基因组测序数据，通过泛基因分析得到的空肠弯曲菌种的种特异性靶标，检测结果更为可靠；同时本发明灵敏度高，最低检测限位5.3×100cfu/g，可以替代传统食品中空肠弯曲菌的检测方法。本发明的检测方法所需时间短，基于crispr/cas12a的检测方法只需将使用紫外灯或蓝光仪器可准确知道样品中空肠弯曲菌的污染情况，缩短检测时间。
1.一种用于检测空肠弯曲菌的核酸检测靶标yclq，其特征在于，所述核酸检测靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种用于检测空肠弯曲菌的pcr/raa引物，其特征在于，所述pcr/raa引物包括核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物。
3.一种用于检测空肠弯曲菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的pcr/raa引物、pcr扩增反应mix1、raa扩增反应mix2、crrna、10×buffer、荧光报告探针和cas12a酶。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述荧光报告探针的组成为fam-ttttt-bhq1。
5.一种利用嵌合荧光法的qpcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括qpcr引物、嵌合荧光法qpcr mix和阳性对照dna，qpcr引物的核苷酸序列如seq id no.2～3所示。
6.一种利用探针法的qpcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括qpcr引物、荧光探针、探针法qpcr mix和阳性对照dna，qpcr引物的核苷酸序列如seq id no.7～8所示，荧光探针的核苷酸序列如seq id no.9所示，探针的5’端修饰vic，3’端修饰tamra。
7.权利要求1所述的核酸检测靶标、权利要求2所述的pcr/raa引物或权利要求3-6任一项所述的试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的空肠弯曲菌检测中的应用。
8.一种非疾病诊断和治疗目的的空肠弯曲菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(c)中，所述crispr/cas12a反应体系为10μl，包括：0.4μl荧光报告探针，0.1μl cas12a酶，0.1μl crrna，1μl 10×buffer，1μl扩增产物，使用ddh2o补充至10μl。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(c)中，所述crispr/cas12a反应条件为：37℃反应20-30min。
