本发明涉及荧光分析，主要涉及一种高灵敏度的酶放大时间分辨荧光定量分析方法。
背景技术：
1、大分子生物分析仪器目前有msd和多功能酶标仪，msd本身灵敏度高，特异性强，为业内金标准，但缺点是试剂高度依赖进口，且价格费用高，周期长，仪器维护费用昂贵。多功能酶标仪性价比会高很多，但对技术人员的要求也会更高。时间分辨荧光包括解离法时间分辨荧光、酶放大时间分辨荧光和均相时间分辨荧光(htrf)，由于解离法和均相时间分辨荧光的试剂高度依赖进口，一样存在价格费用高，周期长，且实验灵敏度欠佳的问题，新开发出来的酶放大时间分辨荧光在试剂货期、费用、灵敏度方面都有较大的改善。
2、时间分辨荧光分析的原理是，对一些常见的荧光基团来说，其荧光寿命普遍处于10-100ns左右，而镧系元素及其螯合物的荧光寿命可达103-106ns，因此在检测信号时，利用两次激发光脉冲的间隔，等待杂散信号的寿命衰减之后再进行荧光强度的检测，可以大大减少其他信号的干扰，提高信噪比和灵敏度。
3、酶放大时间分辨荧光分析，实质是将生物素-链霉亲和素系统的高亲和力和放大作用、酶放大作用、镧系元素复合物的特有优点和时间分辨测量技术结合，通过碱性磷酸酶的酶促作用使磷酸单酯水解产物与tb3+-edta荧光发展溶液形成了发荧光的三元复合物，通过测量荧光强度计算待测物质的含量，是一种高灵敏度的无放射性污染的分析方法，具有良好的发展前景。
4、但是现有的酶放大时间分辨荧光分析还存在以下问题：目前常用的磷酸单酯有5-氟水杨酸磷酸酯和2-氟尼柳磷酸酯，5-氟水杨酸磷酸酯成本低，但是其作为酶放大时间分辨荧光分析的底物时，灵敏度较低；2-氟尼柳磷酸酯的灵敏度高，但高度依赖进口，试剂货期长、费用高，不利于稳定的分析方法的构建。
5、因此，急需对磷酸单酯等进行优化，构建一种新的酶放大时间分辨荧光分析方法，以解决灵敏度低或成本高、货期长的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种高灵敏度的酶放大时间分辨荧光定量分析方法，底物5-氟水杨酸磷酸酯(5-fsap)在合成工艺上进行改进，大大提升体系的灵敏度，增加检测的线性范围，同时降低试剂成本，缩短试剂货期；另外提供了一种荧光发展液，优化了其组成，使定量分析的灵敏度达到最高。
2、一方面，本发明提供了一种酶放大时间分辨荧光定量分析方法，所述方法以5-氟水杨酸磷酸酯作为底物，5-氟水杨酸磷酸酯以式ⅰ所示化合物为原料合成。
3、
4、进一步的，式ⅰ所示化合物合成5-氟水杨酸磷酸酯的方法包括步骤：
5、s1，式ⅰ所示化合物与pcl5反应；
6、s2，将s1产物在60℃下静置2小时；
7、s3，将s2产物与h2o反应。
8、进一步的，5-氟水杨酸磷酸酯的合成工艺如式ⅱ所示。
9、
10、式ⅱ合成工艺为：
11、i)取反应物1，溶解于丙酮和甲苯中，冰浴至0℃，搅拌下缓慢滴加pcl5控制温度保持0℃；
12、ii)滴加完毕后，加热至60℃，停止搅拌，在60℃下静置2h；
13、iii)冰浴至0℃，控制0℃加入纯水，滴加完毕后不再控制温度，可以从0℃反应至室温，16h后结束反应，柱纯化得5-fsap。
14、通过工艺的改进，避免了不易分离的杂质产生，降低杂质含量，使纯化后的5-fsap产品纯度更高；通过60℃的高温静置，促进干扰酶促反应的结构类似物降解，使得到的5-fsap产品与酶的反应活性更强，使得酶促反应的产物更多，进一步促进免疫反应复合物的生成，提高灵敏度。
15、具体而言，工艺优化体现为以下四个方面：
16、第一，步骤i除常用的溶剂丙酮外，还加入了甲苯作为溶剂，有助于提高反应速率，提高产品纯度；第二，步骤i在0℃下进行反应，避免其他副产物的生成，有助于提高产品纯度；第三，步骤ii为新增加的步骤，在60℃下静置2h，有助于副产物中干扰酶促反应的结构类似物的降解，提高最终产物与酶的反应活性；第四，步骤iii在0℃下进行反应，避免其他副产物的生成，有助于提高产品纯度。
17、进一步的，所述5-氟水杨酸磷酸酯浓度为0.1mm-1mm。
18、优选的，所述5-氟水杨酸磷酸酯浓度为0.5mm。
19、进一步的，所述方法还包括加入荧光发展液，荧光发展液含有tbcl3、edta、naoh。
20、优选的，所述荧光发展液中naoh浓度为0.125mm。
21、优选的，所述荧光发展液含有0.2mm tbcl3(氯化铽)、0.2mm edta。
22、另一方面，本发明提供了一种酶放大时间分辨荧光定量分析方法，所述方法以2-氟尼柳磷酸酯作为底物，所述方法还包括加入荧光发展液，荧光发展液含有0.2mm tbcl3、0.2mm edta、0.125m naoh。
23、利用本发明改进后的荧光发展液，同样能够大幅提升以2-氟尼柳磷酸酯作为底物的定量分析灵敏度。
24、另一方面，本发明提供了一种底物用于制备提升酶放大时间分辨荧光定量分析的灵敏度的试剂的用途，所述底物为5-氟水杨酸磷酸酯，5-氟水杨酸磷酸酯的合成工艺如式ⅱ所示。
25、另一方面，本发明提供了一种荧光发展液用于制备提高酶放大时间分辨荧光定量分析的灵敏度的试剂的用途，荧光发展液含有0.2mm tbcl3、0.2mm edta、0.125m naoh。
26、另一方面，本发明提供了一种试剂组合物用于制备提升酶放大时间分辨荧光定量分析的灵敏度和线性范围的试剂的用途，所述试剂组合物包括底物、荧光发展液；底物为5-氟水杨酸磷酸酯或2-氟尼柳磷酸酯，5-氟水杨酸磷酸酯的合成工艺如式ⅱ所示；荧光发展液含有0.2mm tbcl3、0.2mm edta、0.125m naoh。
27、底物的合成工艺改进与荧光发展液的改进对体系的灵敏度和线性范围起到了协同效果，具体而言，在未优化底物的合成工艺前，无论哪一种荧光发展液都无法起到效果，灵敏度低，线性范围窄；在改进前的荧光发展液作用下，即使改进了底物的合成工艺，灵敏度只有少量提升；只有同时具备底物的合成工艺改进与荧光发展液的改进，体系的灵敏度和线性范围才会大幅提升。
28、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
29、1、构建了一种新的酶放大时间分辨荧光定量分析方法，检测的线性范围和信噪比大幅提升，具备更高的检测灵敏度，应用前景广泛；
30、2、为底物5-氟水杨酸磷酸酯的制备提供了新的原料，并提供了一种新合成工艺，制备得到的底物5-氟水杨酸磷酸酯纯度更高，与酶的反应活性更强，在最佳底物浓度下，改进合成工艺制备的底物5-氟水杨酸磷酸酯相较于改进前制备的，定量分析方法的信噪比提升10倍以上，灵敏度提升两个数量级；
31、3、改进了荧光发展液的组成，一方面改善了检测灵敏度，在新合成工艺制备得到的5-氟水杨酸磷酸酯或2-氟尼柳磷酸酯作为底物的情况下，信噪比均有大幅改善，另一方面，降低了各组分试剂的浓度，降低了方法的成本。
1.一种酶放大时间分辨荧光定量分析方法，其特征在于，所述方法以5-氟水杨酸磷酸酯作为底物，5-氟水杨酸磷酸酯以式ⅰ所示化合物为原料合成。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，式ⅰ所示化合物合成5-氟水杨酸磷酸酯的方法包括步骤：
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，5-氟水杨酸磷酸酯的合成工艺如式ⅱ所示。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述方法还包括加入荧光发展液，荧光发展液含有tbcl3、edta、naoh。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述荧光发展液中naoh浓度为0.125mm。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述荧光发展液含有0.2mm tbcl3、0.2mm edta。
7.一种酶放大时间分辨荧光定量分析方法，其特征在于，所述方法以2-氟尼柳磷酸酯作为底物，所述方法还包括加入荧光发展液，荧光发展液含有0.2mm tbcl3、0.2mm edta、0.125m naoh。
8.一种底物用于制备提升酶放大时间分辨荧光定量分析的灵敏度的试剂的用途，其特征在于，所述底物为5-氟水杨酸磷酸酯，5-氟水杨酸磷酸酯的合成工艺如式ⅱ所示。
9.一种荧光发展液用于制备提高酶放大时间分辨荧光定量分析的灵敏度的试剂的用途，其特征在于，荧光发展液含有0.2mm tbcl3、0.2mm edta、0.125m naoh。
10.一种试剂组合物用于制备提升酶放大时间分辨荧光定量分析的灵敏度和线性范围的试剂的用途，其特征在于，所述试剂组合物包括底物、荧光发展液；底物为5-氟水杨酸磷酸酯或2-氟尼柳磷酸酯，5-氟水杨酸磷酸酯的合成工艺如式ⅰ所示；荧光发展液含有0.2mmtbcl3、0.2mm edta、0.125m naoh。
