本发明属于生物医学工程领域，具体涉及到一种用于伤口愈合的可注射活性敷料的制备方法。
背景技术：
1、目前，病损组织器官修复主要依靠自体和异体移植，即从自身或异体供体部位移植到缺损部位。但供体组织器官数量有限，异体移植细胞的免疫排斥等问题得不到有效解决。
2、水凝胶(hydrogel)是以水为分散介质的胶体状高分子材料。是一种高分子网络体系，能吸收大量的水分，性质柔软，且能保持一定的形状。具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物。
3、原位热敏水凝胶是组织器官修复的可行候选材料，因为其快速和可逆的溶胶-凝胶转变行为取决于温度而无需其他外部刺激，如ph、光或化学、酶交联剂。这种热敏水凝胶可以设计为加载抗菌和生物活性因子的伤口敷料，用于抗菌治疗和加速愈合。普兰尼克（pluronic）是一种两亲型性三嵌段共聚物，由亲水性聚氧乙烯（peo）和疏水性聚氧丙烯（ppo）-聚氧化乙烯（pee）共聚合而成。是一种具有良好生物相容性和药物缓释功能的温敏性水凝胶，具有在体温下的反向热凝胶特性，为创口周围组织再生提供细菌屏障和湿润的愈合条件。然而，单一的pluronic聚合物，如pluronic f127和f68，形成胶束时普遍存在稳定性差、功能单一等问题，促进组织器官修复的效果较差，限制了在临床中的应用。
4、已知组织器官修复是一个复杂的生物学过程，是炎症细胞、修复细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同参与并高度调节、相互协调的复杂过程。单独将活细胞和生物活性物质（或活性因子）注射到病损部位，常被宿主体液冲刷掉或被当成异物吞噬掉，起不到促进组织器官修复的目的。固体高分子材料植入体内时需要预先确定病损部位的体积、形状，进行手术切割等，引起伤口感染、炎症反应、免疫排斥等一系列并发症或副反应，达不到理想的治疗效果。
5、本发明提供了一种促进伤口愈合的可注射活性敷料，综合利用活细胞、生物活性物质、药物和双网络普兰尼克（f127/f68）水凝胶的优良特性，构建既可注射型活性敷料，以促进组织器官制造和修复。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种促进伤口愈合的可注射活性水凝胶。首次将活细胞、生物活性分子、细胞外泌体、细胞因子、生长因子、脱细胞基质材料与双网络普兰尼克（f127/f68）水凝胶复合，制备可注射活性水凝胶。该活性水凝胶具备良好的生物相容性、抗菌能力、抗张能力和组织再生能力。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。
3、本发明提供了一种促进伤口愈合的可注射活性水凝胶，其特征在于，所述可注射活性水凝胶包括活细胞、生物活性物质、药物和双网络普兰尼克水凝胶。
4、进一步地，所述双网络普兰尼克水凝胶中f127与f68所占质量百分比w/w%可为9:1～1:9，其中最优比例为18:5。
5、进一步地，所述活细胞包括成体活细胞、干细胞中的一种或两种以上复合物；其形态可以是纳米微球、离心沉淀物、不定形、细胞悬液；其含量在双网络普兰尼克水凝胶中的质量百分比为0.1%～10%。
6、进一步地，所述生物活性物质包括细胞因子、生长因子、细胞外泌体、有机高分子、细胞外基质材料（ecm）、脱细胞外基质材料（dat）、无机氧化物、硫化物、无机盐及微量元素中的一种或两种以上复合物；其形态可以是粉末、纳米颗粒、纳米微球或不定形；其含量在双网络普兰尼克水凝胶中的质量百分比为0.01%～20%。
7、进一步地，所述药物包括治疗用物和预防性生物制剂--疫苗中的一种或两种以上复合物；其形态可以是粉末状、纳米颗粒、纳米微球或不定形；其含量在双网络普兰尼克水凝胶中的质量百分比为0.01%～1%。
8、本发明还提供了一种上述任一所述可注射活性水凝胶在制备病损组织器官修复材料中的应用方法，所述病损组织器官修复包括糖尿病创面、肿瘤切除空缺部位填充、粉碎性骨折、软组织修复、压疮、痔疮及美容整形中的应用。
9、本发明还提供了一种上述任一所述可注射活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
10、（1）双网络普兰尼克水凝胶制备：将f127、f68粉末分别以一定比例混合后溶于pbs溶液、dmem细胞培养液或水中，4℃环境中溶胀12h，升温至37℃，搅拌均匀；
11、（2）活细胞悬液制备：收集细胞放入培养瓶中培养，将培养瓶中融合度达80%以上的细胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta消化、离心，制得离心沉淀物，将离心沉淀物悬浮于0.5mlpbs溶液或dmem细胞培养液中，制得活细胞悬浮液；
12、（3）生物活性物质微球制备：将明胶粉末溶于pbs溶液，制成质量百分比为10%～30%的明胶溶液；或将明胶、海藻酸钠粉末分别溶于pbs溶液，制成质量百分比为20%、5%的明胶、海藻酸钠溶液，两者以1：1混合，制得明胶/海藻酸钠混合溶液；将细胞、生长因子、细胞外泌体、药物粉末或离心沉淀物等分别或两个以上复合后加入0.5ml pbs溶液或细胞培养液，再以质量百分比为0.01%～20%加入明胶或明胶/海藻酸钠混合液中，搅拌均匀，制得含细胞、生长因子、细胞外泌体及药物的明胶或明胶/海藻酸钠混合物，利用注射器将含细胞、生长因子、细胞外泌体及药物的明胶或明胶/海藻酸钠混合物分别注入京尼平pbs溶液（京尼平浓度为10～100mg/ml）或氯化钙pbs溶液中（氯化钙浓度1%～20%（w/v）），过滤、收集含细胞、生长因子、细胞外泌体及药物的明胶或明胶/海藻酸钠纳米微球；
13、（4）活细胞、生物活性物质、药物与双网络普兰尼克水凝胶复合：将活细胞、生物活性物质粉末、药物悬浮液或纳米颗粒中的一种或两种以上复合物以0.01%～20%的质量百分比加入到双网络普兰尼克水凝胶中，37℃环境下搅拌均匀，制得含活细胞、生物活性物质及药物的双网络普兰尼克复合生物材料。
14、进一步地，（1）中所述双网络普兰尼克水凝胶中f127与f68所占质量百分比w/w%可为9:1～1:9，其中最优比例为18:5。
15、与现有技术比，本发明的有益效果如下。
16、本发明所述的活性水凝胶具备良好的生物相容性、抗菌能力、抗张能力和组织再生能力。一方面为组织和器官制造提供新型材料，另一方面为伤口，如糖尿病创面（dws）、肿瘤切除部位、脂肪组织缺损、骨缺损、压疮/痔疮，愈合修复及整形美容提供新的方法和途径。
1.一种促进伤口愈合的可注射活性水凝胶，其特征在于，所述可注射活性水凝胶包括活细胞、生物活性物质、药物和双网络普兰尼克水凝胶。
2.根据权利要求1所述的可注射活性水凝胶，其特征在于，所述双网络普兰尼克水凝胶中f127与f68所占质量百分比w/w%可为9:1～1:9，其中最优比例为18:5。
3.根据权利要求1所述的可注射活性水凝胶，其特征在于，所述活细胞包括成体活细胞、干细胞中的一种或两种以上复合物；其形态可以是纳米微球、离心沉淀物、不定形、细胞悬液；其含量在双网络普兰尼克水凝胶中的质量百分比为0.1%～10%。
4.根据权利要求1所述的可注射活性水凝胶，其特征在于，所述生物活性物质包括细胞因子、生长因子、细胞外泌体、有机高分子、细胞外基质材料（ecm）、脱细胞外基质材料（dat）、无机氧化物、硫化物、无机盐及微量元素中的一种或两种以上复合物；其形态可以是粉末、纳米颗粒、纳米微球或不定形；其含量在双网络普兰尼克水凝胶中的质量百分比为0.01%～20%。
5.根据权利要求1所述的可注射活性水凝胶，其特征在于，所述药物包括治疗用物和预防性生物制剂--疫苗中的一种或两种以上复合物；其形态可以是粉末状、纳米颗粒、纳米微球或不定形；其含量在双网络普兰尼克水凝胶中的质量百分比为0.01%～1%。
6.一种权利要求1～5任一所述可注射活性水凝胶在制备病损组织器官修复材料中的应用方法，所述病损组织器官修复包括糖尿病创面、肿瘤切除空缺部位填充、粉碎性骨折、软组织修复、压疮、痔疮及美容整形中的应用。
7.一种权利要求1～5任一所述可注射活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的复合生物材料的制备方法，其特征在于，（1）中所述双网络普兰尼克水凝胶中f127与f68所占质量百分比w/w%可为9:1～1:9，其中最优比例为18:5。
