本发明涉及分析化学，具体涉及一种溴辅助菲并咪唑苯胺同位素标记试剂及其制备方法与应用，尤其涉及一种利用溴辅助菲并咪唑苯胺同位素标记试剂作为衍生化试剂联合高效液相色谱三重四极杆质谱对全氟羧酸污染物及类似物进行定性或定量分析的方法。
背景技术：
1、全氟羧酸属于一类新污染物，经过多年的生产和使用，目前是广泛分布在环境介质或人体内的重要污染物之一。人类或活体动植物可通过吸入、饮水、皮肤接触、摄食、新陈代谢等途径暴露于全氟羧酸的危害。全氟羧酸污染物具有致癌性、免疫毒性、发育毒性、肝毒性、生殖毒性和内分泌干扰等毒理作用，流行病学研究表明，暴露于全氟羧酸引起的氧化应激与这些疾病之间存在显著关联性。近年来，由于斯德哥尔摩公约以及各国管控措施限制，很多氟化工企业开发了全氟羧酸类似物用于生产替代。这些全氟羧酸类似物具有与全氟羧酸类似的化学结构，虽然能避开管控范围，但其毒理和危害效应已经在当前的毒理研究中得到确认：具有全氟羧酸类似的毒性效应。但是，在环境&健康研究中，对于微量人体样本或含量极低的样本，比如血液、唾液、毛发、组织等，由于其含量低、基质干扰严重、全氟羧酸检测灵敏性有限等原因，全氟羧酸及其类似物的高灵敏、高准确度分析检测存在巨大挑战。
2、液相色谱-质谱法是目前全氟羧酸分析检测的主要技术手段。但是，由于全氟羧酸及其类似物的化学结构所致，其质谱电离效率低、易受基质干扰、灵敏性差、类似物容易裂解等，对它们进行灵敏、准确的分析表征存在很大的分析挑战。因此，探索建立一种灵敏、准确、特异的定性/定量分析方法是十分重要和必要的。qiu等人报道了一种利用对溴苯甲酰溴为衍生化试剂(journal of chromatography a,2012,1235:132-140)，通过液相色谱-质谱对河水中的全氟羧酸进行分析检测的方法。但该方法衍生化反应条件苛刻，衍生产物对温度较为敏感，易分解，衍生化试剂决定了灵敏度不高。基于对衍生化试剂结构设计的前期研究基础，以及我们对液相色谱-质谱分析方法在代谢组/暴露组分析领域的进展，轻/重同位素标签、特征同位素原子(比如溴)等同位素标签引入到具有疏水结构且高电离效率的有机分子结构中，可设计、开发符合要求的同位素标记衍生化试剂。基于此，本发明设计、开发了一种灵敏度高、特异性好、准确度高、衍生化反应条件温和快速的液-质分析方法，这对于探索和评估环境&健康领域全氟羧酸及其类似物相关的暴露或代谢研究具有必要性和重要意义。
技术实现思路
1、针对上述技术中存在的灵敏度、特异性及准确度不足的问题，本发明的目的在于提供一种溴辅助菲并咪唑苯胺同位素标记试剂及其制备方法与环境健康应用。该试剂的咪唑结构中具有一个永久正电荷，这将为全氟羧酸及类似物的标记产物带来极高的质谱检测灵敏度。h/d轻/重同位素标记策略的引入能够降低基质效应，显著提高方法的准确度。溴元素具有的特征同位素79br和81br丰度比约1:1的同位素模式，能够帮助排除假阳性结果，显著提高全氟羧酸及类似物的识别能力，为定性/定量提供极高的保障。
2、因此，本发明提供以下技术方案：
3、一方面，本发明提供一种溴辅助菲并咪唑苯胺同位素标记试剂。
4、具体而言，本发明提供一种菲并咪唑苯胺化合物，其具有以下通式1的结构：
5、
6、其中，r1选自ch3、cd3、h；
7、r2选自ch3、cd3、或不存在，并且当r2选自ch3、cd3时，与r2相连的n带有正电荷；
8、r3选自h、烷酰基、全氟烷酰基。
9、进一步，本发明所述菲并咪唑苯胺化合物，其具有以下结构式5的结构：
10、
11、进一步，本发明所述菲并咪唑苯胺化合物，其具有以下通式2的结构：
12、
13、其中，x为h或d(氘)。
14、进一步，本发明所述菲并咪唑苯胺化合物，其具有以下通式3的结构：
15、
16、其中，x为h或d(氘)。
17、优选的，本发明所述菲并咪唑苯胺化合物以成对的方式提供，优选的所述一对化合物如结构式1、结构式2所示：
18、
19、另一方面，本发明提供上述溴辅助菲并咪唑苯胺同位素标记试剂的制备方法。具体而言：
20、本发明所述菲并咪唑苯胺化合物的制备方法，包括以下步骤：
21、a：将3-溴-9,10-菲醌(结构式3)、4-乙酰氨基苯甲醛(结构式4)与乙酸铵反应，得到结构式5所示的化合物
22、
23、b：将结构式5所示的化合物与碘甲烷(ch3i，结构式6)或氘代碘甲烷(cd3i，结构式7)反应，分别得到结构式8、结构式9所示的化合物
24、
25、
26、c：将结构式8、结构式9所示的化合物水解分别得到结构式1、结构式2所示的化合物
27、
28、进一步，本发明所述菲并咪唑苯胺化合物的制备方法，其中，所述步骤a中结构式3所示化合物：结构式4所示化合物的投料摩尔比为1:1-1.3:1，反应温度为70-90℃，反应时间为1-3h。
29、进一步，本发明所述菲并咪唑苯胺化合物的制备方法，其中，所述步骤b在k2co3存在下反应，结构式5所示化合物：结构式6所示化合物或结构式7所示化合物：k2co3三者的投料摩尔比为1:50:1.2，反应温度为70-90℃，反应时间为5-20h。
30、进一步，本发明所述菲并咪唑苯胺化合物的制备方法，其中，所述步骤c中在18％hcl水溶液中进行水解反应，水解反应温度70-95℃，时间20-35min。
31、另一方面，本发明还提供了利用上述溴辅助菲并咪唑苯胺化合物对全氟羧酸及其类似物进行衍生中的应用。具体而言：
32、本发明提供上述菲并咪唑苯胺化合物作为全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物衍生化试剂的应用，
33、优选的，所述全氟羧酸选自全氟丁酸、全氟庚酸，所述全氟羧酸类似物选自全氟(2-甲基-3-氧杂己酸)、2,3,3,3-四氟-2(1,1,2,3,3,3-六氟-2-(全氟丙氧基)丙氧基)丙酸；
34、优选的，衍生化的全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物用于hplc-ms/ms液质联用分析。
35、另一方面，本发明还提供了利用上述菲并咪唑苯胺同位素标记化合物检测全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物的方法。具体而言：
36、本发明提供一种检测全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物的方法，其包括
37、利用上述菲并咪唑苯胺化合物对全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物进行衍生化的步骤：
38、将全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物与所述菲并咪唑苯胺化合物在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc·hcl)、n-羟基丁二酰亚胺(nhs)同时存在和催化下发生衍生化反应，优选的溶剂为乙腈、反应条件为70℃30min；
39、优选的，所述方法还包括将衍生化的全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物进行hplc-ms/ms液质联用分析。
40、本发明的优点和有益效果：
41、本发明首次合成一种溴辅助菲并咪唑苯胺同位素标记试剂，用于全氟羧酸及其类似物的衍生化，衍生反应条件温和、速度快，产物稳定。该试剂结构包含了一个分子内永久正电荷、一个h/d轻/重同位素标签、一个特征性的溴同位素原子等创新性特色优势，显著提高了分析方法的色谱分离度，质谱灵敏度、特异性、准确度，显著降低基质效应。本发明提供的分析方法应用范围广，具体验证了能够应用于人体或实验动物血浆中全氟羧酸及其类似物的定性/定量检测，方法适用性好。解决了目前全氟羧酸及其类似物在质谱定性/定量分析方面的关键问题，特别是克服了现有技术直接分析法中全氟羧酸类似物自身易发生源内裂解的缺点。本发明提供的用于检测全氟羧酸及其类似物的溴辅助菲并咪唑苯胺同位素标记试剂，其合成方法路线短、杂质少、产率高、结构稳定。
42、第一、本发明合成了一种溴辅助菲并咪唑苯胺标记试剂，该试剂含有分子内永久正电荷以及n、o杂原子，在色谱分离时能够为分析物带来良好的色谱分离度，在质谱检测时能够产生特异性的含有h/d同位素标签、br同位素特征以及全氟羧酸及其类似物的子离子，可带来卓越的质谱分析定性以及定量性能。
43、第二、本发明在有机合成步骤b中将ch3i替换为氘代试剂cd3i，得到的氘代化合物(结构式2)与全氟羧酸及其类似物的衍生产物可作为该分析物的氘代内标，为靶向和非靶向代谢组/暴露组分析中液相色谱-质谱定性/定量提供了强有力的保障，并且省略了购买内标物的昂贵费用、解决了内标物缺乏的技术瓶颈。
44、第三、本发明溴辅助菲并咪唑苯胺同位素标记试剂中br同位素特征(79br:81br丰度比约1:1)的引入，能够排除质谱定性/定量假阳性结果，提高了在代谢组/暴露组非靶向扫描中的特异性识别能力。
1.一种菲并咪唑苯胺化合物，其特征在于，其具有以下通式1的结构：
2.如权利要求1所述菲并咪唑苯胺化合物，其特征在于，其具有以下结构式5的结构：
3.如权利要求1所述菲并咪唑苯胺化合物，其特征在于，其具有以下通式2的结构：
4.如权利要求1所述菲并咪唑苯胺化合物，其特征在于，其具有以下通式3的结构：
5.一种如权利要求1-4任一项所述菲并咪唑苯胺化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述菲并咪唑苯胺化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤a中结构式3所示化合物：结构式4所示化合物的投料摩尔比为1:1-1.3:1，反应温度为70-90℃，反应时间为1-3h。
7.如权利要求5所述菲并咪唑苯胺化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤b在k2co3存在下反应，结构式5所示化合物：结构式6所示化合物或结构式7所示化合物：k2co3三者的投料摩尔比为1:50:1.2，反应温度为70-90℃，反应时间为5-20h。
8.如权利要求5所述菲并咪唑苯胺化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤c中在18％hcl水溶液中进行水解反应，水解反应温度70-95℃，时间20-35min。
9.权利要求1-4任一项所述菲并咪唑苯胺化合物作为全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物衍生化试剂的应用，其特征在于，
10.一种检测全氟羧酸和/或全氟羧酸类似物的方法，其特征在于，包括：
