本发明涉及生物工程，具体涉及一种环状rna转录载体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、环状rna广泛存在生物体内，发挥着其重要的特殊的生物功能如蛋白海绵，mirna海绵，蛋白支架，转录调节等。随着线性mrna在疫苗等方面的应用推广，作为不需帽子结构修饰的环状rna也逐渐引起人们的关注。体外生产环状rna主要包括三种方式：第一种为利用化合物如溴化氢(brcn)促使线性rna形成3’-5’磷酸酯键，但其纯化成本高，产量低，只能用于70nt-80nt的rna，在实际生产中很难得到推广。第二种为酶连法，通过t4 rna连接酶可以使双链rna或单链rna催化成环，其环化效率要比化学法高，但其能成环的rna大小局限在250nt范围。第三种为利用核酶在体外自剪切拼接成环，如pie系统(permuted-intron-exon，pie)。所利用到的核酸酶主要是i型自剪接内含子或ii型自剪接内含子。i型自剪接内含子自剪接反应过程中需要gtp以及mg2+的参与，ii型自剪接内含子成环过程中则无需gtp的参与，可通过自身内部序列的腺苷酸2’-oh作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二酯键，发生转脂反应。
2、现有技术中，ra wesselhoeft等人公开的环状rna体外转录载体是目前使用较为广泛的体外转录载体，具有体外成环效率高、蛋白翻译效率好，不易降解等优点。但该载体如cvb3-gluc-pac(full)，在实际的使用中亦存在局限性，该载体在体外转录反应(invitro transcription，ivt)中，容易受温度波动影响，导致多个剪切位点产生，且这些剪切位点副产物不具备载体表达活性，从而导致环状rna表达效率下降、下游去除副产物困难，生产成本增加等一系列缺点。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种环状rna转录载体及其制备方法和应用。
2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
3、第一方面，本发明提供了一种环状rna转录载体，包括以下结构元件：外部5’同源臂、核酶、内部5’同源臂、5’间隔序列、ires、多克隆位点或编码区、3’间隔序列、内部3’同源臂、核酶、外部3’同源臂。
4、本发明通过优化环状rna转录载体内部3’同源臂、内部5’同源臂序列，避免了体外转录过程中受温度波动影响导致的多种环化副产物的产生，保证了所生产的环状rna产物的单一性，稳定性且高效表达，降低生产成本。
5、作为本发明所述的环状rna转录载体的优选实施方式，所述外部5’同源臂如seqid no.1所示；所述外部3’同源臂如seq id no.2所示。
6、作为本发明所述的环状rna转录载体的优选实施方式，所述内部5’同源臂或所示内部3’同源臂为不含自剪切核酶位点或不参与核酶剪切反应的同源序列。
7、作为本发明所述的环状rna转录载体的优选实施方式，所述核酶为i型自剪切内含子核酶或ii型自剪切内含子核酶中的任一种。
8、作为本发明所述的环状rna转录载体的优选实施方式，其核苷酸序列为seq idno.3-seq id no.9中的任意一种。
9、第二方面，本发明提供了一种所述的环状rna转录载体的制备方法，包括以下步骤：
10、所述载体的模板线性化后体外转录反应，再环化催化反应，然后rnase-r酶消化反应，纯化，即成。
11、第三方面，本发明提供了一种工程细胞，由所述的环状rna转录载体转染获得。
12、作为本发明所述的工程细胞的优选实施方式，所述细胞为hek293。
13、第四方面，本发明将所述的环状rna转录载体、所述的工程细胞在基因工程和/或蛋白生产中应用。
14、作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述基因工程包括制备环状rna表达分子。
15、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
16、本发明通过逆转录方法分析该转录载体在不同温度的ivt反应生产的环状rna产物剪切位点特性，采用点突变的方法对环状rna转录载体内部3’同源臂、内部5’同源臂序列进行不同的优化设计，使得到的转录载体保留高表达特性，同时不受ivt温度影响，克服了原先载体存在的受体外转录温度影响的多个自剪切拼接位点缺陷，保证了后期环化的rna产物的单一性及稳定性，为产品表达效率以及生产成本的降低提供新的方法，对环状rna体外制备工艺的发展及环状rna的进一步应用具有重要意义。
1.一种环状rna转录载体，其特征在于，包括以下结构元件：外部5’同源臂、核酶、内部5’同源臂、5’间隔序列、ires、多克隆位点或编码区、3’间隔序列、内部3’同源臂、核酶、外部3’同源臂。
2.根据权利要求1所述的环状rna转录载体，其特征在于，所述外部5’同源臂如seq idno.1所示；所述外部3’同源臂如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述的环状rna转录载体，其特征在于，所述内部5’同源臂或所示内部3’同源臂为不含自剪切核酶位点或不参与核酶剪切反应的同源序列。
4.根据权利要求1所述的环状rna转录载体，其特征在于，所述核酶为i型自剪切内含子核酶或ii型自剪切内含子核酶中的任一种。
5.根据权利要求1所述的环状rna转录载体，其特征在于，其核苷酸序列为seq idno.3-seq id no.9中的任意一种。
6.权利要求1-5任一所述的环状rna转录载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.一种工程细胞，其特征在于，由权利要求1-5任一所述的环状rna转录载体转染获得。
8.根据权利要求7所述的工程细胞，其特征在于，所述细胞为hek293。
9.权利要求1-5任一所述的环状rna转录载体、权利要求7或8所述的工程细胞在基因工程和/或蛋白生产中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述基因工程包括制备环状rna表达分子。
