本发明涉及生物工程领域，尤其涉及表达模块、重组质粒、重组菌株及其应用。
背景技术：
1、维生素d3(vd3)是一种脂溶性维生素，属于人类生长、生命和维持健康所需的类固醇激素家族，而vd3可以通过紫外线照射由7-脱氢胆固醇(7-dhc)合成。工业上通常以羊毛脂为原料，通过酯化、烯丙基氧化、还原、水解和消除反应可以合成7-dhc，该过程需要添加大量的有机试剂，容易对环境造成污染。此外，反应过程中温度和压力的变化可能会产生各种副产物。相比之下，通过微生物发酵合成7-dhc由于副产物较少、良好的可持续性和环境保护而更具吸引力。
2、解脂耶氏酵母被美国食品和药物管理局(fda)视为安全酵母，用于生产包括功能性脂质在内的增值化合物，琥珀酸、β-胡萝卜素、虾青素和芳香族聚酮化合物。与酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母由于其对脂质底物的高效利用而显示出更好的工业应用前景。作为一种产油酵母，解脂耶氏酵母具有成熟的脂质代谢途径。特别是，解脂耶氏酵母本身具有内源甲羟戊酸途径，参与角鲨烯的生物合成，角鲨烯是7-dhc的重要前体。
3、由于合成生物学和代谢工程的快速发展，微生物生产7-dhc正在成为一种替代且有前途的途径。2006年，lang等首次通过在酿酒酵母中整合7-dhc合成途径的必需基因，实现了7-dhc在酿酒酵母中的从头合成。随后，研究人员开发了多种代谢工程和合成生物学工具和策略来提高7-dhc的合成效率。张莹等通过过表达thmg1和erg1，增强甲羟戊酸合成路径通量，敲除erg5和erg6阻断麦角固醇合成路径，引入人源dhcr24，使7-dhc的产量提升至5.5mg/gdcw。2021年，天津大学郭晓静等人采用区室化工程策略，将7-dhc合成路径中的erg2、erg3、dhcr24、erg25、erg26、erg27靶向脂滴，erg1、erg11、erg24靶向内质网，摇瓶中7-dhc的产量达到360.6mg/l。为预测7-dhc合成途径中潜在的限速步骤，qu等利用基因组规模代谢网络模型预测了7-dhc代谢网络中的关键调控节点，并进一步利用crispri系统调控关键节点相关基因的表达水平，最终使7-dhc在3l发酵罐中的产量达到1328mg/l。xiu等采用系统合成生物学策略，通过过表达6个关键基因来提高前体供应，构建并应用crispr激活和抑制系统使代谢通量更多地流向7-dhc合成途径，将甾醇合成路径定位于内质网，最终使7-dhc在摇瓶中的产量达到455.6mg/l，在5l罐中的产量达到2870mg/l。在解脂耶氏酵母中，苏皖等人通过敲除erg5基因，并导入人源dhcr24基因进行了初步尝试，重组解脂耶氏酵母菌株摇瓶发酵产生27.91mg/l的7-dhc。目前，对于7-dhc酵母合成研究主要聚焦于酿酒酵母，对于解脂耶氏酵母作为底盘的研究较少。
4、微生物合成7-dhc的主要经济挑战是原料的高成本。利用工业和生活废物作为产油真菌的底物来生产7-dhc不仅可以解决废物管理问题，而且也是提高工艺经济性的可持续且潜在低成本的方法。厨余垃圾(kw)是指食品生产和消费过程中产生的废物或食堂和餐馆的剩余物，其处理方式是直接排放到陆地或水体中，造成环境危害。使用微生物策略将kw转化为增值产品，例如生物表面活性剂、生物柴油、生物乙醇、有机酸和生物电已成为研究热点。值得注意的是，解脂耶氏酵母在将含油废物生物转化为各种天然产物方面具有很高的潜力，kw含有高含量的游离脂肪酸能够被解脂耶氏酵母吸收作为碳源。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了表达模块、重组质粒、重组菌株及其应用。本发明提供了用于高效合成7-dhc解脂耶氏酵母细胞工厂，确定了最佳的生产培养基，以及实现了从废弃脂质原料中高效合成7-dhc，为未来大规模7-dhc生物生产铺平了道路。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了如下任意项在生产和/或制备7-脱氢胆固醇中的应用；
4、(i)、外源基因的表达；和/或
5、(ii)、内源基因的过表达和/或敲除；
6、所述外源基因包括：鸡源的gg_dhcr24基因、斑马鱼源的dr_dhcr24基因、热带爪蟾源的xt_dhcr24基因、牛源的bt_dhcr24基因和平流芽孢杆菌来源的lip2基因中的一种或多种；
7、所述内源基因包括：erg10、erg13、hmg1、erg12、erg8、erg19、idi、erg20、erg5、erg6和dga1中的一种或多种。
8、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述敲除的内源基因包括：erg5和/或erg6。
9、本发明还提供了核酸分子，包括：dhcr24基因；
10、所述dhcr24基因包括：鸡源的gg_dhcr24基因、斑马鱼源的dr_dhcr24基因、热带爪蟾源的xt_dhcr24基因和牛源的bt_dhcr24基因中的任意一种；
11、所述鸡源的gg_dhcr24基因具有：
12、(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或
13、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
14、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同一性的核苷酸序列；和/或
15、所述斑马鱼源的dr_dhcr24的基因具有：
16、(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或
17、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
18、(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同一性的核苷酸序列；和/或
19、所述热带爪蟾源的xt_dhcr24的基因具有：
20、(7)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或
21、(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
22、(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90％同一性的核苷酸序列；和/或
23、所述牛源的bt_dhcr24基因具有：
24、(10)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或
25、(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
26、(12)、与(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90％同一性的核苷酸序列。
27、在本发明的一些实施方案中，上述核酸分子为：牛源的bt_dhcr24基因。
28、本发明还提供了质粒，包括：上述核酸分子。
29、在本发明的一些实施方案中，上述质粒，还包括：敲除erg5基因和/或erg6基因。
30、在本发明的一些实施方案中，上述质粒包括：敲除erg5基因和erg6基因，表达牛源的bt_dhcr24基因。
31、本发明还提供了宿主，转化和/或转染上述质粒。
32、在本发明的一些实施方案中，上述宿主包括：酵母菌、藻类、酶菌和细菌中的一种或多种。
33、在本发明的一些实施方案中，上述宿主中，所述酵母菌包括：解脂耶氏酵母、酿酒酵母和克鲁维属酵母中的任意一种。
34、在本发明的一些实施方案中，上述宿主中，所述解脂耶氏酵母包括：atcc 201249或atcc mya-2613(po1f)。
35、在本发明的一些实施方案中，上述宿主中，所述解脂耶氏酵母为：atcc mya-2613(po1f)。
36、本发明还提供了表达模块，包括：启动子、内源基因和终止子；
37、所述内源基因包括：erg10、erg13、hmg1、erg12、erg8、erg19、idi和erg20中的一种或多种。
38、在本发明的一些实施方案中，上述表达模块中，所述启动子包括：php8d、pfba1in、pexp1和ptef1in中的任意一种；
39、所述终止子包括：toct1、txpr2、tcyc1和tt8中的任意一种。
40、在本发明的一些实施方案中，上述表达模块包括：pfba1in-erg12-txpr2、pfba1in-erg10-tcyc1、pexp1-erg13-tt8、php8d-erg8-txpr2、pfba1in-erg19-tcyc1、pexp1-idi-txpr2、pexp1-erg20-txpr2、pfba1in-hmg1-tcyc1和pexp1-hmg1-txpr2。
41、在本发明的一些实施方案中，上述表达模块中所述pfba1in-hmg1-tcyc1的拷贝数为2。
42、本发明还提供了重组质粒，包括：上述表达模块。
43、本发明还提供了菌株，将上述重组质粒转化和/或转染上述宿主。
44、本发明还提供了表达质粒，包括：平流芽孢杆菌来源的lip2基因和/或dga1；
45、所述lip2基因具有：
46、(13)、如seq id no:85所示的核苷酸序列；或
47、(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
48、(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有90％同一性的核苷酸序列。
49、本发明还提供了重组菌株，将上述表达质粒转化和/或转染上述菌株。
50、本发明还提供了产品，包括：上述核酸分子、上述质粒、上述宿主、上述表达模块、上述重组质粒、上述菌株、上述表达质粒和上述重组菌株中的一种或多种。
51、本发明还提供了模型，所述模型的公式为：y＝19.13+1.23a-0.62b+2.12c+0.75ab-0.056ac-0.33bc-1.46a2-0.074b2-3.54c2；
52、其中：y为发酵产物的产量，a为培养基中碳源的浓度，b为培养基中蛋白胨的浓度；c为培养基中酵母提取物的浓度。
53、在本发明的一些实施方案中，上述y为7-脱氢胆固醇的产量。
54、本发明还提供了上述模型在制备培养基中的应用。
55、本发明还提供了培养基，包括：60～100g/l的碳源、15～25g/l的蛋白胨和5～15g/l的酵母提取物。
56、在本发明的一些实施方案中，上述培养基中，所述碳源包括：葡萄糖和/或厨余垃圾。
57、在本发明的一些实施方案中，上述培养基，包括：83.1g/l的碳源、15g/l的蛋白胨和11.7g/l的酵母提取物。
58、本发明还提供了上述核酸分子、上述质粒、上述宿主、上述表达模块、上述重组质粒、上述菌株、上述表达质粒、上述重组菌株、上述产品、上述模型和/或上述培养基在如下任意项中的应用；
59、(i)、制备和/或生产7-脱氢胆固醇；和/或
60、(ii)、提高7-脱氢胆固醇的产量；和/或
61、(iii)、降解厨余垃圾。
62、本发明还提供了7-脱氢胆固醇的制备方法，包括如下步骤：
63、s1：将上述宿主、上述菌株和/或上述重组菌株接种培养，获得种子液；
64、s2：将所述种子液发酵培养，获得发酵液；
65、s3：收集所述发酵液的沉淀，皂化反应，萃取，干燥，获得所述7-脱氢胆固醇；
66、s1中所述接种培养和s2中所述发酵培养均采用上述培养基。
67、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述发酵培养还包括补充碳源的步骤。
68、本发明提供了如下任意项在生产和/或制备7-脱氢胆固醇中的应用；
69、(i)、外源基因的表达；和/或
70、(ii)、内源基因的过表达和/或敲除；
71、所述外源基因包括：鸡源的gg_dhcr24基因、斑马鱼源的dr_dhcr24基因、热带爪蟾源的xt_dhcr24基因、牛源的bt_dhcr24基因和平流芽孢杆菌来源的lip2基因中的一种或多种；
72、所述内源基因包括：erg10、erg13、hmg1、erg12、erg8、erg19、idi、erg20、erg5、erg6和dga1中的一种或多种。
73、本发明提供了用于高效合成7-dhc解脂耶氏酵母细胞工厂，确定了最佳的生产培养基，以及实现了从废弃脂质原料中高效合成7-dhc，为未来大规模7-dhc生物生产铺平了道路。
1.如下任意项在生产和/或制备7-脱氢胆固醇中的应用；
2.核酸分子，其特征在于，包括：dhcr24基因；
3.质粒，其特征在于，包括：如权利要求2所述的核酸分子。
4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，还包括：敲除erg5基因和/或erg6基因。
5.宿主，其特征在于，转化和/或转染如权利要求3或4所述的质粒。
6.表达模块，其特征在于，包括：启动子、内源基因和终止子；
7.如权利要求6所述的表达模块，其特征在于，所述启动子包括：php8d、pfba1in、pexp1和ptef1in中的任意一种；
8.重组质粒，其特征在于，包括：如权利要求6或7所述的表达模块。
9.菌株，其特征在于，将如权利要求8所述的重组质粒转化和/或转染如权利要求5所述的宿主。
10.表达质粒，其特征在于，包括：平流芽孢杆菌来源的lip2基因和/或dga1；
11.重组菌株，其特征在于，将如权利要求10所述的表达质粒转化和/或转染如权利要求9所述的菌株。
12.产品，其特征在于，包括：如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3或4所述的质粒、如权利要求5所述的宿主、如权利要求6或7所述的表达模块、如权利要求8所述的重组质粒、如权利要求9所述的菌株、如权利要求10所述的表达质粒和如权利要求11所述的重组菌株中的一种或多种。
13.模型，其特征在于，所述模型的公式为：y＝19.13+1.23a-0.62b+2.12c+0.75ab-0.056ac-0.33bc-1.46a2-0.074b2-3.54c2；
14.如权利要求13所述的模型在制备培养基中的应用。
15.培养基，其特征在于，包括：60～100g/l的碳源、15～25g/l的蛋白胨和5～15g/l的酵母提取物。
16.如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3或4所述的质粒、如权利要求5所述的宿主、如权利要求6或7所述的表达模块、如权利要求8所述的重组质粒、如权利要求9所述的菌株、如权利要求10所述的表达质粒、如权利要求11所述的重组菌株、如权利要求12所述的产品、如权利要求13所述的模型和/或如权利要求15所述的培养基在如下任意项中的应用；
17.7-脱氢胆固醇的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
18.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养还包括补充碳源的步骤。
