本发明属于动物微细胞生物，具体属于egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法。
背景技术：
1、乳腺癌（bc）已成为威胁女性生命的重大疾病之一。尽管全球在癌症检测与治疗方面取得了显著进步，根据globacan 的数据，在大多数国家中，乳腺癌仍位居第五大癌症，占所有癌症死亡病例的约六分之一。然而，导致乳腺癌进展的确切原因尚需进一步明确。
2、近年来，体外细胞培养技术在生物医药领域，尤其是癌症研究中发挥着至关重要的作用。传统的二维（2d）细胞培养虽然简便易行，但其平面化的培养环境往往无法真实再现体内肿瘤细胞复杂的三维（3d）结构、细胞间相互作用及与细胞外基质（ecm）的动态交互，导致细胞行为、药物反应及信号传导等方面的研究结果与体内实际情况存在显著差异。
3、水凝胶作为一种生物相容性良好、可调控的三维支架材料，能够模拟体内微环境，为细胞提供三维立体空间，促进细胞形成类似体内组织的三维结构。其中，海藻酸钠水凝胶由于其良好的生物相容性、可降解性、易于交联成型以及对多种生长因子的良好负载能力，成为构建体外类器官培养模型的理想选择。
4、乳腺癌类器官的构建主要由三种元素组成，即乳腺癌细胞、细胞外基质和细胞因子。 具体来说，将乳腺癌细胞或组织制作成组织悬液，接种到以生物材料（含多种生长因子）作为细胞外基质的培养皿中，然后加入乳腺癌类器官培养基进行培养。然而，现有技术在构建水凝胶体外培养乳腺癌类器官体系时，存在以下问题：
5、（1）制备好的单细胞悬液大多加到分离自小鼠肉瘤的可溶性基底膜提取物（matrigel）中，以此建立类器官培养体系，其大多数成分是未定义的，由于批次间的变化以及基质凝胶制剂中机械性能的局部变化，会将差异引入类器官培养物，导致类器官的变异性和不良的可重复性。
6、（2）水凝胶的egf释放控制不足：乳腺癌类器官增殖所需的egf在水凝胶中的释放通常缺乏有效的调控手段，可能导致过快释放或不均匀分布，无法模拟体内环境的稳态分布和作用模式；或者使用其他方式使其与另外一些物质结合以达到缓控释的效果，但是这极有可能改变egf在体内的释放方式或egf的性质。
7、（3）体系稳定性欠佳：现有体系在长时间培养过程中可能出现水凝胶降解过快、细胞活力下降等问题，影响实验的连续性和数据的可靠性。
8、因此，构建合适的水凝胶体外培养体系，能够在研究乳腺癌类器官生物学行为、药物筛选及个性化治疗策略开发等方面提供更为精准和仿生的实验平台。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明利用内部结构均匀、egf(表皮生长因子)释放稳定的egf储备水凝胶，提供了一种egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法。
2、所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，包括以下步骤：
3、s1、海藻酸钠冻干水凝胶的制备：
4、s101、称取海藻酸钠粉末，配制浓度为2w/v%~4w/v%海藻酸钠溶液；
5、s102、将步骤s101制得的海藻酸钠凝胶以800 μl体积加入到预冷处理后的24孔板中，将所述24孔板进行冷冻冻干处理，制得海藻酸钠冻干凝胶；
6、s2、海藻酸钠-ca2+冻干水凝胶的制备：
7、s201、将步骤s102中制得的海藻酸钠冻干凝胶浸没于预先配制好浓度为2w/v%的cacl2溶液中，进行交联反应1 h；
8、s202、步骤s201交联反应结束后，取出交联后的水凝胶并置于无菌蒸馏水中洗涤3~5次以去除未反应的cacl2；
9、s203、除去洗涤液后将步骤s202得到的水凝胶进行消毒处理，消毒后，用无菌蒸馏水洗涤3~5次，制得海藻酸钠-ca2+冻干水凝胶；
10、s3、egf储备水凝胶的制备：
11、s301、将步骤s203中制得的海藻酸钠-ca2+冻干水凝胶重置于预冷的24孔板中进冷冻冻干处理，确保水分完全去除；
12、s302、对步骤s301中海藻酸钠-ca2+冻干水凝胶进行灭菌处理；
13、s303、使用无菌操作技术，用无菌pbs或细胞培养基将高浓度的egf溶液进行稀释；
14、s304、在无菌条件下，将步骤s303中稀释后的egf溶液以200 μl/孔的量滴加到步骤s203中的含有海藻酸钠-ca2+冻干水凝胶的孔板中，轻轻晃动孔板，确保egf溶液均匀分布；
15、s305、将步骤s304中添加了egf溶液的孔板置于4℃环境中静置孵育1 h，使egf溶液充分渗透并被海藻酸钠-ca2+冻干水凝胶吸收，然后将所述水凝胶进行冷冻冻干处理，制得egf储备水凝胶；
16、s4、类器官培养体系的构建：
17、s401、将乳腺癌组织提取的单细胞加入含10%胎牛血清和5%青霉素-链霉素的dmem培养基中，制成单细胞悬液；
18、s402、将100 μl步骤s401中的单细胞悬液加入步骤s305制得的egf储备水凝胶中，静置30 min使单细胞悬液被egf储备水凝胶吸收完全；
19、s403、补充500~800 ml完全培养基浸没步骤s402中的水凝胶，将所述水凝胶放入37℃、含5% co2的细胞培养箱中培养3~7 d，得到乳腺癌类器官。
20、本发明针对乳腺癌细胞中egfr表达阳性的事实，确认egf在乳腺癌发展中扮演着重要驱动角色。然而，常规凝胶载体对egf的储存能力有限且稳定性差，通常依赖于与其它物质复合以延长保质期，但这种方法往往无法真实再现egf在体内对乳腺癌细胞的自然刺激效应。为此，本发明创新性地采用海藻酸钠凝胶体系，其能直接与egf发生相互作用，有效维持egf的生物活性。同时，结合多次冻干工艺，旨在显著提升egf的储存量，解决现有储存问题并优化其在科研及潜在治疗应用中的性能。
21、优选的，步骤s101中，所述海藻酸钠溶液的溶剂为蒸馏水或无菌pbs缓冲液。
22、优选的，步骤s101中，采用磷酸盐缓冲液将海藻酸钠溶液的ph值调至7.2~7.4。
23、优选的，在进行步骤s102之前，用0.22 μm滤膜对步骤s101中的海藻酸钠溶液进行过滤除菌处理。
24、优选的，在进行步骤s102之前，将步骤s101中配制的海藻酸钠溶液置于4 ℃的环境中静置20~60 min，通过静置消除海藻酸钠溶液中的气泡，使制备的海藻酸钠冻干水凝胶的内部结构更加均匀。
25、优选的，步骤s201中，为使海藻酸钠与ca2+充分交联，将海藻酸钠冻干凝胶浸没于预先配制好浓度为2w/v%的cacl2溶液中后，置于4 ℃恒温水浴振荡器中，设定振荡速度为50~100 rpm，交联反应1 h。
26、优选的，步骤s203中，所述的消毒处理为采用70%~75%的乙醇溶液进行浸泡消毒，消毒处理时长为6 h。
27、优选的，步骤s302中，所述的灭菌处理为通过紫外照射的方式对步骤s301中海藻酸钠-ca2+冻干水凝胶的进行灭菌处理，灭菌处理时长为1 h。
28、优选的，步骤s401中，所述的单细胞悬液的密度为50~100 w/ml。
29、优选的，步骤s303中，所述的egf溶液稀释后的浓度为6 μg/ml。
30、优选的，所述的冷冻冻干的条件为-80 ℃的环境下冷冻8 h，冷冻后于温度为-40~-80 ℃，压力为10~20 pa的条件下冻干8~12 h。
31、相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
32、本发明通过精心设计的海藻酸钠冻干水凝胶制备过程，确保水凝胶内部结构均匀、egf储存和释放稳定，为乳腺癌细胞提供了一个高度仿生、可控的三维培养环境。本发明所提供的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，没有采用matrigel培养体系，避免了其导致乳腺癌类器官的变异性和不良的可重复性。此外，本发明还实现了对egf释放模式的精细调控，有助于模拟体内egf的生理效应，为研究egf对乳腺癌类器官行为的影响提供了精确的体外模型，为深入研究乳腺癌类器官生物学特性、药物筛选及个性化治疗策略开发提供了更为精准、可靠的体外模型。
1. egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤s101中，所述海藻酸钠溶液的溶剂为蒸馏水或无菌pbs缓冲液。
3.根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤s101中，采用磷酸盐缓冲液将海藻酸钠溶液的ph值调至7.2~7.4。
4. 根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，在进行步骤s102之前，将步骤s101中配制的海藻酸钠溶液置于4 ℃的环境中静置20~60 min。
5. 根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，在进行步骤s102之前，用0.22 μm滤膜对步骤s101中的海藻酸钠溶液进行过滤除菌处理。
6. 根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤s201中，为使海藻酸钠与ca2+充分交联，将海藻酸钠冻干凝胶浸没于预先配制好浓度为2w/v%的cacl2溶液中后，置于4 ℃恒温水浴振荡器中，设定振荡速度为50~100 rpm，交联反应1 h。
7. 根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤s203中，所述的消毒处理为采用70%~75%的乙醇溶液进行浸泡消毒，消毒处理6h。
8. 根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤s302中，所述的灭菌处理为通过紫外照射的方式对步骤s301中海藻酸钠-ca2+冻干水凝胶的进行灭菌处理，灭菌处理时长为1 h。
9. 根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤s303中，所述的egf溶液稀释后的浓度为6 μg/ml。
10. 根据权利要求1所述的egf储备水凝胶体外培养乳腺癌类器官的构建方法，其特征在于，所述的冷冻冻干的条件为-80 ℃的环境下冷冻8 h，冷冻后于温度为-40~-80 ℃，压力为10~20 pa的条件下冻干8~12 h。
