本发明属于生物工程，涉及一种增强正调控蛋白基因转录水平的方法，以提高轮枝链霉菌（ s. verticillus）中转谷氨酰胺酶（transglutaminase，tgase）的发酵水平，具体涉及一种高产转谷氨酰胺酶的重组载体、重组菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
1、转谷氨酰胺酶是一种蛋白质酰基转移酶，能使蛋白质分子内/间发生交联聚合形成稳定的、不溶性大分子复合物，影响蛋白质的发泡性、稳定性和凝胶性等。作为一种重要的酶制剂，tgase不仅广泛用于肉制品、乳制品、植物蛋白、食品包装及保藏等领域，在纺织和医药工业也具有较大的市场前景，预计2029年全球tgase市场规模将达到3.0亿美元。因此，应进一步研究tgase的工业生产和改良技术，以降低其生产成本并提高生化性能。
2、自然界中tgase来源丰富，其中微生物源的tgase具有非ca2+依赖性、催化效率高和底物特异性低等特点，更适合工业上广泛使用。本实验室前期筛选发现，工业上生产博来霉素的轮枝链霉菌具有合成tgase的能力。与报道的其它各种微生物来源的相比， s. verticillus合成的tgase在较宽范围的温度和ph条件下，仍然具有较高的活性和稳定性，且其发酵时间为48h，低于目前工业上使用的生产菌株。作为链霉菌属中高度保守的全局转录因子，dasr蛋白通常直接与启动子内保守型 dre序列结合，控制天然产物合成基因的转录。本发明研究发现在 dasr编码基因过表达菌株中tgase的合成量却显著增加，因此，本发明基于dasr的正调控作用，通过构建 s. verticillus的 dasr基因过表达菌株以提高tgase发酵产量，目前尚没有该方面的相关报道。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供了一种高产转谷氨酰胺酶的重组载体、重组菌株及其构建方法，通过构建 dasr基因过表达轮枝链霉菌菌株以提高tgase发酵水平，具体说是利用基因工程方法提高 dasr基因转录水平，从而正调控tgase的生物合成，进而提高tgase的发酵产量，该重组载体或重组菌株能够用于制备高产转谷氨酰胺酶的生物发酵制剂。
2、本发明为实现上述目的采用如下技术方案：
3、一种高产转谷氨酰胺酶的重组载体，其特征在于：该重组载体为过表达 dasr编码基因的整合型质粒载体pdasr，其中 dasr编码基因的基因序列如seq id no. 1所示。
4、进一步地，所述 dasr编码基因来源于野生菌株 s. verticillus atcc15003；所述整合型质粒载体pdasr来源于质粒pib139（pset152衍生质粒）。
5、进一步地，所述整合型质粒载体pdasr通过组成型强启动子 ermep*控制 dasr编码基因的过表达获得，该整合型质粒载体pdasr的基因序列如seq id no. 2所示。
6、一种高产转谷氨酰胺酶的重组载体的构建方法，其特征在于具体过程为：通过pcr扩增野生菌株 s. verticillus atcc15003基因组中的 dasr全长片段，再通过同源重组的方法克隆至整合型质粒载体pib139中的 nde i和 xba i位点，其中pcr扩增采用的引物序列为seq id no. 3和seq id no. 4所示的引物 dasr-f和 dasr-r。
7、一种高产转谷氨酰胺酶的重组菌株，其特征在于：将整合型质粒载体pdasr通过接合转移的方法导入野生菌株 s. verticillus atcc15003，再通过基因重组将整合型质粒载体pdasr整合至野生菌株 s. verticillus atcc15003染色体中的attp位点后获得的高产转谷氨酰胺酶的重组菌株。
8、一种高产转谷氨酰胺酶的重组菌株的构建方法，其特征在于具体过程为：通过扩增来源于野生菌株 s. verticillus atcc15003中 dasr全长基因片段，将其导入整合型质粒pib139后获得由强启动子 ermep*控制的 dasr基因过表达载体pdasr，即整合型质粒载体pdasr，再通过接合转移导入野生菌株 s. verticillus atcc15003后获得 dasr基因过表达菌株，即高产转谷氨酰胺酶的重组菌株。
9、本发明所述高产转谷氨酰胺酶的重组载体或高产转谷氨酰胺酶的重组菌株在制备高产转谷氨酰胺酶生物发酵制剂中的应用，通过增强 dasr的基因转录水平来提高 s. verticillus中tgase的发酵产量。
10、进一步地，通过扩增来源于野生菌株 s. verticillus atcc15003中 dasr全长基因片段，将其导入整合型质粒pib139后获得由强启动子 ermep*控制的 dasr基因过表达载体pdasr，再通过接合转移导入野生菌株 s. verticillus atcc15003后获得 dasr基因过表达菌株，摇瓶发酵后转谷氨酰胺酶产量显著提高。
11、进一步地，利用改良版isp4固体培养基培养和保存高产转谷氨酰胺酶的重组菌株的孢子，待孢子成熟后进行摇瓶发酵，摇瓶发酵具体过程为：将成熟孢子接入液体种子培养基中，在220rpm和28℃条件下培养48h获得成熟的种子液，再将成熟的种子液按照10wt%的接种量接种至发酵培养基中，在220rpm和28℃条件下培养48h，收集发酵液获得转谷氨酰胺酶。
12、进一步地，所述改良版isp4固体培养基的组成为：淀粉1wt%、酵母浸粉0.05wt%、酪蛋白0.1wt%、k2hpo4 0.1wt%、nacl 0.1wt%、mgso4 0.1wt%、kno3 0.3wt%、caco3 0.2wt%、痕量溶液1.0ml/l和琼脂1.5wt%~2.0wt%，其中痕量溶液的组成为：feso4·7h2o 0.01g/l、mncl2·4h2o 0.01g/l和znso4·7h2o 0.01g/l；所述液体种子培养基的组成为：胰蛋白胨20g/l、可溶性淀粉20g/l、k2hpo4 2g/l、kh2po4 2g/l、酵母浸粉2g/l和mgso4 2g/l，ph7.0；所述发酵培养基的组成为：胰蛋白胨30g/l、可溶性淀粉10g/l、无水葡萄糖10g/l、k2hpo4 2g/l、酵母浸粉2g/l和mgso4 1g/l，ph7.0。
13、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
14、1、本发明构建了一种新的高产tgase重组菌株，其合成的tgase在较宽范围的温度和ph条件下，仍然具有较高的活性和稳定性，且其发酵时间为48h，低于目前工业上使用的其它生产菌株。
15、2、本发明提供了一种提高tgase发酵产量的方法，即通过过表达全局转录因子dasr的编码基因，提高菌体胞内 dasr基因的转录水平，在实验室摇瓶发酵条件下，tgase酶活提高约4倍，因此，通过本发明提供的方法能显著提高tgase发酵产量。
1.一种高产转谷氨酰胺酶的重组载体，其特征在于：该重组载体为过表达dasr编码基因的整合型质粒载体pdasr，其中，dasr编码基因的基因序列如seq id no. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的高产转谷氨酰胺酶的重组载体，其特征在于：所述dasr编码基因来源于野生菌株s. verticillus atcc15003；所述整合型质粒载体pdasr来源于质粒pib139。
3. 根据权利要求1所述的高产转谷氨酰胺酶的重组载体，其特征在于：所述整合型质粒载体pdasr通过组成型强启动子ermep*控制dasr编码基因的过表达获得，该整合型质粒载体pdasr的基因序列如seq id no. 2所示。
4. 一种权利要求1~3中任意一项所述的高产转谷氨酰胺酶的重组载体的构建方法，其特征在于具体过程为：通过pcr扩增野生菌株s. verticillus atcc15003基因组中的dasr全长片段，再通过同源重组的方法克隆至整合型质粒载体pib139中的nde i和xba i位点，其中，pcr扩增采用的引物序列为seq id no. 3和seq id no. 4所示的引物dasr-f和dasr-r。
5. 一种高产转谷氨酰胺酶的重组菌株，其特征在于：将权利要求1中所述整合型质粒载体pdasr通过接合转移的方法导入野生菌株s. verticillus atcc15003，再通过基因重组将整合型质粒载体pdasr整合至野生菌株s. verticillus atcc15003染色体中的attp位点后，获得的高产转谷氨酰胺酶的重组菌株。
6. 一种权利要求5所述的高产转谷氨酰胺酶的重组菌株的构建方法，其特征在于具体过程为：通过扩增来源于野生菌株s. verticillus atcc15003中dasr全长基因片段，将其导入整合型质粒pib139后，获得由强启动子ermep*控制的dasr基因过表达载体pdasr，即整合型质粒载体pdasr，再通过接合转移导入野生菌株s. verticillus atcc15003后获得dasr基因过表达菌株，即高产转谷氨酰胺酶的重组菌株。
7. 权利要求1~3中任意一项所述的高产转谷氨酰胺酶的重组载体或权利要求5所述的高产转谷氨酰胺酶的重组菌株在制备高产转谷氨酰胺酶生物发酵制剂中的应用，通过增强dasr的基因转录水平来提高s. verticillus中tgase的发酵产量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于具体过程为：利用改良版isp4固体培养基培养和保存高产转谷氨酰胺酶的重组菌株的孢子，待孢子成熟后进行摇瓶发酵，摇瓶发酵具体过程为将成熟孢子接入液体种子培养基中，在220rpm和28℃条件下培养48h获得成熟的种子液，再将成熟的种子液按照10wt%的接种量接种至发酵培养基中，在220rpm和28℃条件下培养48h，收集发酵液获得转谷氨酰胺酶。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述改良版isp4固体培养基的组成为：淀粉1wt%、酵母浸粉0.05wt%、酪蛋白0.1wt%、k2hpo4 0.1wt%、nacl 0.1wt%、mgso4 0.1wt%、kno3 0.3wt%、caco3 0.2wt%、痕量溶液1.0ml/l和琼脂1.5wt%~2.0wt%，其中痕量溶液的组成为：feso4·7h2o 0.01g/l、mncl2·4h2o 0.01g/l和znso4·7h2o 0.01g/l；所述液体种子培养基的组成为：胰蛋白胨20g/l、可溶性淀粉20g/l、k2hpo4 2g/l、kh2po4 2g/l、酵母浸粉2g/l和mgso4 2g/l，ph7.0；所述发酵培养基的组成为：胰蛋白胨30g/l、可溶性淀粉10g/l、无水葡萄糖10g/l、k2hpo4 2g/l、酵母浸粉2g/l和mgso4 1g/l，ph7.0。
