本发明涉及微生物基因工程，具体而言，涉及一种合成2’-fl的大肠杆菌及合成2’-fl的方法。
背景技术：
1、母乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是人乳中一类非单一结构、非消化性碳水化合物的总称，对婴幼儿的健康及生长发育具有重要作用，已被用作婴儿配方食品的功能性成分。2’-岩藻糖基乳糖(2’fucosyllactose，2’-fl)是母乳寡糖中含量最多的一种，约占总母乳寡糖的1/3，是目前最具有潜力的一种母乳寡糖。2’-岩藻糖基乳糖具有调节肠道菌群、抵抗病原菌的黏附、免疫调节及促进神经系统发育和修复等多种功能，已被多个国家或地区批准作为婴儿配方奶粉的添加剂，具有较大的应用价值和市场需求。2’-fl可通过α1,2岩藻糖基转移酶，以gdp l岩藻糖(gdp l fucose，gdp l fuc)和乳糖为底物合成。
2、此外，提高辅因子atp和gtp的再生能力也是提高2′fl产量的有效策略。近年来，多种ntp再生系统被设计、构建，并用于调控微生物合成代谢中内关键酶的辅因子，如gdp/gtp、adp/atp等的浓度和形式来最大化目标产物的代谢流。多聚磷酸激酶(ppk)是广泛存在于细菌基本代谢途径中的重要保守酶，可以催化amp、adp、gmp和gdp磷酸化为相应的核苷二磷酸酯和三磷酸酯。
3、例如，以多磷酸盐(poly(p))为供体，amp为起始物，将ppk和amp磷酸转移酶(pap)结合起来可以从amp和poly(p)中再生atp，进一步与乙酰coa合成酶结合起来，构建了以乙酰coa合成酶为载体的pap ppkatp再生体系，并成功用于乙酰coa的合成中。目前广泛存在的polyp激酶包括聚磷酸激酶i族(f a m i l y i p o l y p h o s p h a t e k i n as e,p p k 1)和聚磷酸激酶ⅱ族(familyiipolyphosphatekinase,ppk2)。其中，ppk2被证明是一种gdp聚磷酸激酶，对gdp具有较高的亲和力，可以利用poly(p)优先将gdp转化为gtp。研究人员利用一个来源于哈氏噬纤维菌(cytophaga hutchinsonii)的双功能多磷酸激酶ppk2建立了基于单一聚磷酸激酶的无细胞蛋白合成ntp再生体系，可以在重组无细胞蛋白质合成系统中构建一个人工atp/gtp再生系统来驱动蛋白质的合成。优化后的单激酶再生系统产生的sfgfp最终浓度(530μg/ml)比三激酶体系产生的浓度(400μg/ml)高1.3倍，且mrna翻译速率比三激酶体系快5倍。因此，提高进一步提高辅因子的再生能力对提高2′fl产量至关重要。
4、目前，工程菌的辅因子的再生能力较低。
5、鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种合成2’-fl的大肠杆菌及合成2’-fl的方法以解决上述技术问题。
2、本发明提供一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌，大肠杆菌沉默表达大肠杆菌内源的底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因、乳糖代谢相关基因以及中间产物gdp-l-岩藻糖分解代谢相关基因；
3、底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因包括：gdp-甘露糖水解酶基因nudk、gdp-甘露糖基水解酶nudd和poxb基因；
4、乳糖代谢相关基因选自β-半乳糖苷酶基因lacz；
5、gdp-l-岩藻糖分解代谢相关基因选自udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj和lon基因；
6、加强表达磷酸甘露糖变位酶编码基因manb、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶编码基因manc、gdp-甘露糖-6-脱氢酶编码基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶编码基因wcag、2’-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futc、β-半乳糖苷透性酶编码基因lacy、并加强表达nadph及其前体nadp+代谢相关基因；
7、nadph及其前体nadp+代谢相关基因为nad激酶基因nadk、异柠檬酸nad+脱氢酶基因icd、苹果酸酶基因maeb、可溶性吡啶核苷酸转移酶编码基因stha、6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因zwf和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因gnd。
8、发明人发现：通过在大肠杆菌中上调2'-fl从头合成途径上基因manb,manc,gmd，wcag，lacy，futc的表达水平，并敲除大肠杆菌内源的与底物l-岩藻糖和乳糖以及关键中间产物gdp-l-岩藻糖分解代谢相关基因，同时引入nadph代谢相关基因和gtp代谢相关基因中的任一种，通过精准调控微生物合成代谢中内关键酶的辅因子从而提升gdp-l-岩藻糖的产量，进而在α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化作用下，以gdp-l-岩藻糖(gdp-l-fucose，gdp-l-fuc)和乳糖为底物合成2’-岩藻糖基乳糖(2'-fl)。本发明提供的大肠杆菌能够显著提升2’-岩藻糖基乳糖的产量达到3.9g/l，具备良好的工业应用前景。
9、术语基因的“加强表达”或“沉默表达”涉及与所述基因在岩藻糖基乳糖生产过程的任何阶段的野生型表达相比的表达变化。与野生型相比，“加强表达”是更高的表达，“沉默表达”是更低的表达，其中术语“加强表达”还定义为在内源基因的情况下所述基因的“过表达”或在野生型菌株中不存在的异源基因的情况下的“表达”。沉默表达是通过技术人员常用的熟知技术(如使用sirna、crispr、crispri、重组工程、同源重组、ssdna诱变、rnai、mirna、asrna、突变基因、敲除基因、转座子诱变等方法)用于改变基因，使其能力较差(即与功能性野生型基因相比在统计学上显著“能力较差”)或完全无法(例如敲除-基因)产生功能性终产物。
10、“加强表达”或“沉默表达”是通过技术人员常用的熟知技术获得的。
11、在上述基础上，进一步强化nadph及其前体ndap+代谢相关基因。首先插入nad激酶基因nadk，该酶特异性催化nad+磷酸化以产生nadp+。其次，强化异柠檬酸nad+脱氢酶基因icd和苹果酸酶基因maeb，可溶性吡啶核苷酸转移酶编码基因stha，6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因zwf和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因gnd，这些基因可以催化nadp+产生nadph。最后将nadph催化为其他物质的基因进行敲除，包括氨酸脱氢酶基因gdha和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi。
12、在本发明应用较佳的实施方式中，底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因还包括：氨酸脱氢酶基因gdha和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi。
13、在本发明应用较佳的实施方式中，在宿主细胞大肠杆菌中敲除lacz，并在lacz位点处整合lacy；敲除wcaj，并在wcaj位点整合futc基因；敲除nudk，并在nudk位点处整合nadk；敲除nudd，并在nudd位点处整合icd；敲除gdha，并在gdha位点处整合maeb；敲除pgi，并在pgi位点处整合stha；敲除lon，并在lon位点处整合zwf；敲除poxb，并在poxb位点处整合gnd。
14、在本发明应用较佳的实施方式中，异柠檬酸nad+脱氢酶基因icd的核苷酸序列如seq id no.6所示，苹果酸酶基因maeb的核苷酸序列如seqid no.7所示，可溶性吡啶核苷酸转移酶编码基因stha的核苷酸序列如seq id no.8所示；
15、优选地，nad激酶基因nadk的gene id为947092，6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因zwf的gene id为946370，6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因gnd的gene id为946554；
16、优选地，β-半乳糖苷透性酶编码基因lacy的gene id为949083，β-半乳糖苷酶基因lacz的gene id为945006，udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj的gene id为946583，gdp-甘露糖水解酶基因nudk的gene id为947072，gdp-甘露糖基水解酶nudd的gene id为946559；poxb的gene id为946132。
17、优选地，氨酸脱氢酶基因gdha的gene id为946802，6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的gene id为948535；
18、优选地，合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌为△lacz::lacy、△wcaj::futc、△nudk::nadk、△nudd::icd、△gdha::maeb、△pgi::stha、△ion::zwf、△poxb::gnd的大肠杆菌。
19、通过敲除lacz基因以减少乳糖被用于合成半乳糖和葡萄糖，进而减少大肠杆菌中用于合成2’-岩藻糖基乳糖的乳糖用量。通过敲除wacj基因，nudk基因，nudd基因，lon基因和poxb基因，从而减少代谢中间产物的流失提高产物生产效率，显著提高2’-fl的产量和得率。
20、在本公开内容的上下文中，术语“内源的”是指作为细胞的天然部分并且出现在其在细胞中的天然位置处的任何多核苷酸、多肽或蛋白质序列。
21、2’-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futc的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述磷酸甘露糖变位酶基因manb的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶编码基因manc的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述gdp-甘露糖-6-脱氢酶编码基因gmd的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述gdp-岩藻糖合成酶编码基因wcag的核苷酸序列如seq id no.5所示。
22、第二方面，本发明还提供了一种提高2’-岩藻糖基乳糖产量的方法，敲除大肠杆菌内源的底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因、乳糖代谢相关基因以及中间产物gdp-l-岩藻糖分解代谢相关基因；
23、底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因包括：gdp-甘露糖水解酶基因nudk、gdp-甘露糖基水解酶nudd和poxb基因；
24、乳糖代谢相关基因选自β-半乳糖苷酶基因lacz；
25、gdp-l-岩藻糖分解代谢相关基因选自udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj和lon基因；
26、加强表达磷酸甘露糖变位酶编码基因manb、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶编码基因manc、gdp-甘露糖-6-脱氢酶编码基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶编码基因wcag、2’-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futc、β-半乳糖苷透性酶编码基因lacy、并加强表达nadph及其前体nadp+代谢相关基因；
27、nadph及其前体nadp+代谢相关基因为nad激酶基因nadk、异柠檬酸nad+脱氢酶基因icd、苹果酸酶基因maeb、可溶性吡啶核苷酸转移酶编码基因stha、6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因zwf和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因gnd。
28、在本发明应用较佳的实施方式中，底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因还包括：氨酸脱氢酶基因gdha和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi。
29、在本发明应用较佳的实施方式中，在宿主细胞大肠杆菌中敲除lacz，并在lacz位点处整合lacy；敲除wcaj，并在wcaj位点整合futc基因；敲除nudk，并在nudk位点处整合nadk；敲除nudd，并在nudd位点处整合icd；敲除gdha，并在gdha位点处整合maeb；敲除pgi，并在pgi位点处整合stha；敲除lon，并在lon位点处整合zwf；敲除poxb，并在poxb位点处整合gnd。
30、第三方面，本发明还提供了一种合成2'-岩藻糖基乳糖的方法，以甘油或葡萄糖为碳源，以乳糖为底物，利用上述的大肠杆菌在28～32℃发酵生产2'-岩藻糖基乳糖。例如在28℃、29℃、30℃、31℃或32℃进行发酵。
31、第四方面，本发明还提供了大肠杆菌在生产2'-岩藻糖基乳糖或含有2'-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
32、本发明具有以下有益效果：
33、发明人发现通过在大肠杆菌中上调2'-fl从头合成途径上基因manb,manc,gmd，wcag，lacy的表达水平，并敲除大肠杆菌内源的与底物l-岩藻糖和乳糖以及关键中间产物gdp-l-岩藻糖分解代谢相关基因，同时引入nadph代谢相关基因，通过精准调控微生物合成代谢中内关键酶的辅因子从而提升gdp-l-岩藻糖的产量，进而在α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化作用下，以gdp-l-岩藻糖(gdp-l-fucose，gdp-l-fuc)和乳糖为底物合成2’-岩藻糖基乳糖(2'-fl)。本发明提供的大肠杆菌能够显著提升2’-岩藻糖基乳糖的产量。摇瓶法将大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的能力提高到3.9g/l，具备良好的工业应用前景。
1.一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌沉默表达大肠杆菌内源的底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因、乳糖代谢相关基因以及中间产物gdp-l-岩藻糖分解代谢相关基因；
2.根据权利要求1所述的合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌，其特征在于，所述底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因还包括：氨酸脱氢酶基因gdha和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi。
3.根据权利要求2所述的合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌，其特征在于，在宿主细胞大肠杆菌中敲除lacz，并在lacz位点处整合lacy；敲除wcaj，并在wcaj位点整合futc基因；敲除nudk，并在nudk位点处整合nadk；敲除nudd，并在nudd位点处整合icd；敲除gdha，并在gdha位点处整合maeb；敲除pgi，并在pgi位点处整合stha；敲除lon，并在lon位点处整合zwf；敲除poxb，并在poxb位点处整合gnd。
4.根据权利要求2所述的合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌，其特征在于，所述异柠檬酸nad+脱氢酶基因icd的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述苹果酸酶基因maeb的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述可溶性吡啶核苷酸转移酶编码基因stha的核苷酸序列如seqid no.8所示；
5.根据权利要求1所述的合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌，其特征在于，所述2’-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futc的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述磷酸甘露糖变位酶基因manb的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶编码基因manc的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述gdp-甘露糖-6-脱氢酶编码基因gmd的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述gdp-岩藻糖合成酶编码基因wcag的核苷酸序列如seq idno.5所示。
6.一种提高2’-岩藻糖基乳糖产量的方法，其特征在于，敲除大肠杆菌内源的底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因、乳糖代谢相关基因以及中间产物gdp-l-岩藻糖分解代谢相关基因；
7.根据权利要求6所述的提高2’-岩藻糖基乳糖产量的方法，其特征在于，所述底物gdp-l-岩藻糖合成相关基因还包括：氨酸脱氢酶基因gdha和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi。
8.根据权利要求7所述的提高2’-岩藻糖基乳糖产量的方法，其特征在于，在宿主细胞大肠杆菌中敲除lacz，并在lacz位点处整合lacy；敲除wcaj，并在wcaj位点整合futc基因；敲除nudk，并在nudk位点处整合nadk；敲除nudd，并在nudd位点处整合icd；敲除gdha，并在gdha位点处整合maeb；敲除pgi，并在pgi位点处整合stha；敲除lon，并在lon位点处整合zwf；敲除poxb，并在poxb位点处整合gnd。
9.一种合成2'-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，以甘油或葡萄糖为碳源，以乳糖为底物，利用权利要求1-5任一所述的大肠杆菌在28～32℃发酵生产2'-岩藻糖基乳糖。
10.权利要求1～5任一所述的大肠杆菌在生产2'-岩藻糖基乳糖或含有2'-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
