本发明属于微藻生物，具体涉及一种利用佐夫色绿藻发酵生产天然虾青素的方法。
背景技术：
1、虾青素是一种脂溶性紫红色酮式类胡萝卜素，不仅具有较强的着色能力，还拥有超强抗氧化能力和多种生物学功能。人工合成虾青素大多作为饲料添加剂，但人工合成虾青素多为顺式结构。相比于合成虾青素，天然反式结构虾青素在结构、功能、应用和安全性等方面更具优势，同浓度天然虾青素的生物吸收效果、着色能力、抗氧化活性和生物效价更高。目前，利用雨生红球藻生产天然虾青素是最常见的方法，但面临着成本高、生产效率低且不稳定、易污染等技术问题，导致天然虾青素的产量远不能满足市场所需。
2、近年来，绿藻门小球藻属中的佐夫色绿藻(chromochloris zofingiensis)因其能在异养高密度培养下积累虾青素而备受国内外学者的关注，有可能成为藻源天然虾青素生产的替代性藻种来源。然而目前的异养模式下佐夫色绿藻虾青素产量很低(发酵10天约0.15g/l左右)，极大制约了佐夫色绿藻作为天然虾青素来源的商业化开发进程。为了提高异养培养下佐夫色绿藻的虾青素产量，最常用的方法是使佐夫色绿藻在适生长条件下细胞生物量达到一定浓度后，通过施加外源诱导剂(包括植物激素如赤霉素、3-吲哚乙酸、3-吲哚丁酸、茉莉酸甲酯、茉莉酸和油菜素内酯等，氧化剂如过氧化氢和氯化钠等)和限/缺氮等胁迫条件相结合诱导虾青素积累。然而，许多诱导剂虽能促进佐夫色绿藻中虾青素的合成，但其成本高、不易获得(特别是植物激素的获取难度大)，并且还存在安全隐患，对藻细胞的生长具有一定抑制作用等而难以实际应用于佐夫色绿藻虾青素的商业化生产。此外，发酵中途添加植物激素和氯化钠等操作不仅使生产过程和控制变得更复杂，还会增加培养过程的染菌风险，且培养过程中大量氯化钠的引入还会腐蚀不锈钢发酵罐体，降低工业发酵罐的使用寿命。因此，需要对现有异养培养佐夫色绿藻生产虾青素的方法提出改进方案。
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种利用佐夫色绿藻发酵生产天然虾青素的方法，通过阶段式调控培养过程ph和营养供应，提高佐夫色绿藻异养发酵生产虾青素产量，解决现有佐夫色绿藻异养方法的虾青素产量低、必须依赖外源诱导剂等操作工艺繁琐、诱导剂存在安全隐患、藻细胞的生长被抑制等问题，实现显著提高佐夫色绿藻发酵的虾青素的含量和产量，为商业化生产藻源虾青素提供技术指导。
3、(二)技术方案
4、本发明提供一种利用佐夫色绿藻发酵生产天然虾青素的方法，包括：将佐夫色绿藻藻种接种到发酵罐基础培养基中进行发酵培养，培养温度为22-30℃，通风比为0.5-2:1(vvm即每分钟通气量与培养液体积比)，搅拌速度和溶解氧偶联控制使溶解氧控制在5-80％；基础培养基为改良endo培养基；
5、发酵培养过程分为细胞生长阶段和诱导虾青素积累两个阶段；
6、在细胞生长阶段，培养过程中控制发酵液ph在6.0-7.0，同时监控发酵液的葡萄糖浓度，在发酵液的葡萄糖浓度≤5g/l时，补充生长补料培养基进行流加培养，直到细胞干重达到170-180g/l时细胞生长阶段结束，转入诱导虾青素积累阶段并将生长补料培养基切换成诱导补料培养基；
7、在诱导虾青素积累阶段，将发酵液ph控制在3-5或8-10以进行诱导培养，同时监控发酵液的葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节诱导补料培养基的补料速度以控制整个诱导虾青素积累阶段的葡萄糖浓度为1-20g/l；当连续两次取样点样品发酵干重不变或开始下降时，发酵培养结束，对藻细胞进行收获以获取虾青素；
8、所述生长补料培养基为全营养培养基，为浓缩的改良endo培养基；所述诱导补料培养基是在全营养培养基为基础进行缺氮和/或缺磷调整得到的培养基。
9、根据本发明的较佳实施例，发酵培养过程中用氨水或2-4m的naoh溶液控制发酵液的ph在要求的范围内。
10、根据本发明的较佳实施例，在所述基础培养基和生长补料培养基中，碳源为葡萄糖，氮源为氯化铵，磷源为磷酸二氢钾；基础培养基中葡萄糖浓度为20±2g/l，氯化铵浓度为1.5±0.15g/l，磷酸二氢钾浓度为0.2±0.02g/l；生长补料培养基中葡萄糖浓度为750±20g/l，氯化铵浓度为1.8-37.5g/l，磷酸二氢钾浓度为60±5g/l。
11、根据本发明的较佳实施例，所述佐夫色绿藻藻种为佐夫色绿藻高产虾青素突变株，突变株名称为chromochloris zofingiensis cz003，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2024676，保藏日期为2024年4月11日。
12、根据本发明的较佳实施例，所述佐夫色绿藻藻种为野生型佐夫色绿藻。
13、根据本发明的较佳实施例，将佐夫色绿藻藻种以种子液的形式接种到发酵罐中进行发酵培养；所述种子液的制备过程为：在无菌环境下，将经摇瓶活化后的佐夫色绿藻细胞以2-10％(v/v)接种量接种于摇瓶中进行振荡暗培养，培养温度22-30℃，转速120-220rpm，培养时间2-5天，得到种子液。
14、根据本发明的较佳实施例，将培养好的摇瓶种子液以5-10％(v/v)接种量接种于发酵罐中进行发酵培养。
15、本技术各培养基组成如下(各组分浓度允许在±10％内小幅调整，更优选在±5％调整时对佐夫色绿藻的培养效果没有明显影响)：
16、摇瓶培养基：葡萄糖30g/l；kno3 2g/l；kh2po4 0.2g/l；mgso4·7h2o0.2g/l；柠檬酸三钠0.2g/l；feso4与edta母液1ml/l；微量元素母液1ml/l，调ph 6.0。
17、基础培养基：葡萄糖20g/l；nh4cl 1.5g/l；kh2po4 0.2g/l；mgso4·7h2o 0.2g/l；柠檬酸三钠0.2g/l；feso4与edta母液1ml/l；微量元素母液1ml/l，调ph6.0。
18、生长补料培养基：葡萄糖750g/l；nh4cl 18-37.5g/l；kh2po4 60g/l；mgso4·7h2o60g/l；柠檬酸三钠5g/l；feso4与edta母液50ml/l；微量元素母液50ml/l。
19、诱导补料培养基为在生长补料培养基去除nh4cl和/或kh2po4。
20、所述feso4与edta母液的组成为：feso4·7h2o 16g/l，edta 2.1g/l。微量元素母液的组成为：h3bo3 2.86g/l，znso4·7h2o 0.222g/l，mncl2·4h2o 1.81g/l，namoo4 0.021g/l，cuso4·5h2o 0.07g/l。
21、(三)有益效果
22、本发明的发酵培养过程分为细胞生长阶段和诱导虾青素积累阶段，在细胞生长阶段以最适宜的生长条件，即ph(6.0-7.0)和全营养型培养基(基础培养基和生长补料培养基)条件下使发酵液中藻细胞快速增长到高密度(170-180g/l)，然后控制ph为3-5或8-10以及提供营养缺失型补料培养基进行诱导培养，从而胁迫佐夫色绿藻细胞快速积累虾青素。通过对照实验证明，本发明所采用的诱导培养条件不仅可刺激藻细胞中虾青素快速积累，而且对藻细胞的生长不产生抑制或负面作用，由此大大提高佐夫色绿藻发酵生产虾青素的产量和产率。
23、本发明采用阶段式ph和营养调控相结合的方式提高佐夫色绿藻异养发酵生产虾青素的产量，培养过程无需外源添加诱导剂(植物激素、盐或过氧化氢等)，发酵过程操作更简单，规模化放大时更容易实施，可避免发酵中途因诱导剂引入操作给发酵生产带来的染菌风险、安全隐患和额外成本投入。由于发酵过程不使用任何诱导剂，因此不存在外原诱导剂抑制藻细胞生长的问题。因此，本发明不仅可提高细胞中虾青素的含量(％)，还能提高发酵液中细胞干重(增加细胞数量)，从而大大提高发酵液中虾青素的产量。相比现有技术，本发明虾青素诱导提升效果显著，在达到相同虾青素含量和产量下所需的诱导时间更短。
1.一种利用佐夫色绿藻发酵生产天然虾青素的方法，其特征在于，包括：将佐夫色绿藻藻种接种到发酵罐基础培养基中进行发酵培养，培养温度为22-30℃，通风比vvm为0.5-2:1，搅拌速度和溶解氧偶联控制使溶解氧控制在5-80％；基础培养基为改良endo培养基；发酵培养过程分为细胞生长阶段和诱导虾青素积累两个阶段；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养过程中用氨水或2-4m的naoh溶液控制发酵液的ph在要求的范围内。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述基础培养基和生长补料培养基中，碳源为葡萄糖，氮源为氯化铵，磷源为磷酸二氢钾；基础培养基中葡萄糖浓度为20±2g/l，氯化铵浓度为1.5±0.15g/l，磷酸二氢钾浓度为0.2±0.02g/l；生长补料培养基中葡萄糖浓度为750±20g/l，氯化铵浓度为18-37.5g/l，磷酸二氢钾浓度为60±5g/l。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述佐夫色绿藻藻种为佐夫色绿藻高产虾青素突变株，突变株名称为chromochloris zofingiensis cz003，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2024676，保藏日期为2024年4月11日。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述佐夫色绿藻藻种为野生型佐夫色绿藻。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，将佐夫色绿藻藻种以种子液的形式接种到发酵罐中进行发酵培养；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将培养好的摇瓶种子液以5-10％的体积百分比接种于发酵罐中进行发酵培养。
8.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，
9.根据权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于，
