本发明涉及基因工程，更具体的说是丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和smbbe3及其应用。
背景技术：
1、丹参(salvia miltiorrhiza)作为中国传统中药，具有活血调经、凉血消痈、清心安神的作用，是一种常用大宗中药材，临床上多用于治疗脑血管疾病，有“一味丹参，共同四物”的美誉。目前，丹参的药效物质已基本明了，丹参中所含的药用成分主要以水溶性的酚酸类化合物和脂溶性的醌类化合物为主，除此之外还有少量黄酮等其他种类化合物。自上世纪80年代以来，我国科研工作者先后从丹参中分得丹参素、丹酚酸a、b、c、d、e、f、g、迷迭香酸、紫草酸、原紫草酸等多种酚酸类化合物。之后经过各国科研工作者的共同努力，又从丹参同属植物中得到丹酚酸h、i、j、k、l1、l2、鼠尾草香豆素等化合物。丹酚酸类化合物(salvianolic acids)是丹参丹参活血化瘀的主要功效成分，具有抗血小板聚集、抗血栓、改善微循环、促进组织恢复、清除自由基和抗脂质过氧化等多种药理活性。
2、丹酚酸b是一种有机化合物，分子式为c36h30o16，相对分子质量为718.62；为棕黄色干燥粉末，纯品为类白色粉末，或淡黄色粉末；味微苦、涩，具引湿性；可溶于水，是丹参中含量最多，活性最强的水溶性成分。既往研究表明，丹参酚酸b具有抗炎、抗纤维化的作用，被广泛应用于多脏器纤维化以及炎症相关的研究中。现有技术存在关于丹酚酸类化合物的生物合成途径，但仅明确到迷迭香酸的合成，迷迭香酸下游其它酚酸类成分如丹酚酸b等的生物合成途径尚不明确。
3、因此如何寻找一种丹酚酸b生物合成途径中的关键酶以及相关基因，促进丹酚酸的合成，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和smbbe3及其应用，基因smbbe2和smbbe3是首次从丹参植物中克隆得到，其所编码的丹参小檗碱桥酶能够催化丹酚酸e生成丹酚酸b，为大规模工业化生产丹酚酸b提供技术支持。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和smbbe3，所述基因smbbe2编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:3所示；所述基因smbbe3编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:4所示。
4、作为优选的技术方案，所述基因smbbe2的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述基因smbbe3的核苷酸序列如seq id no:2所示。
5、seq id no:1
6、atgaaaaatccttcaacctcatctgtctcatcatttcttgaatgcttcgctcaagaatgtgaaaaccactcttcgatcaccaacgttatctacactccaacaaacccttcttacacctctgttcttcaatccaccatccgcaacacaagattcttatccgaatccaccccgaagccgcaagtcatcataaccccagaatccgaaacccagattccaccgatcatccgatgcgccaagaaatgcggtctcgaaatccgaacccgaagcggcggccatgacatggagggactgtcctacgtcgcaaaagtgccgttcgtgatcatcgatttggtcaacctcaccgaagtcaccgtcgacgtcgaggcgaagacggcgtgggtcgaggccggcgcgaccaccggcgtcgtatactacaagatcgccgagaagacccgcactctgggcttccccggggccatctgcactacagtcggcgtcggcgggcactacggtggggggggctacggcaccctcctcagaaaatacggcctcgccggagataacgtcattgatgcgagaatcgtcgacgccaacggcgacatcctcgacagagagtcaatgggcgaggatctgttctgggcgatcagaggcggcggcgccgccagcttcggcgtggtcactgcttggaagatacagctcgtcgatgttccagaaacagtcactgttttctcaatcctgaggaatgtggaagagcagaacggcgccgagctgtggcaccgctggcaatacgtggcgcctcaggccgacaaggatttgttcgtcggagtcatcgtgtacagagccgacacgatggtccaggttaatttcttctacgctttccaaggcggcgcggatagattagtttcatatatgcaagaagtcttccctgagctggggctagtgagagaagactgcaccgagatgagctgggtcgaatccaccttattcagcaaccaaatgccgatcgatccacttgatgctctgctcaaccggatccaacccggcctcagacagctcaaagccaagtcggattatgtccgaacagcagtccctttggacgcgattcaaggcatggtgagcatgctacgtgaaccagaagcagacgagactatttactacatggttccatacggtggaagaatggatgagatatcagaatcggagactccgtttcctcacagagctggtgcgctctacaagctcgccggcttaacctactggcaagactccgaggcagcagatgcagacagatacataagctggagccgcaagtattacgaatacatgactccttacgtctcgagctcgcccagggaagcgtatctcaactacagagatctcgacatcggagtgaataacgttgtcggtgagacgagttacgagcaagccagcgtttgggggaagccttactacaaggataatttcgatcgtcttgttcgggttaagaccgctgtggatccggataatttcttcaggaatgaacagagcattccgccggtgtgcaagtctgccgccggtatttaa。
7、seq id no:2
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11、seq id no.4
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13、本发明的再一目的在于提供：丹参小檗碱桥酶smbbe2和smbbe3，其中丹参小檗碱桥酶基因smbbe2编码的氨基酸序列如seq id no:3所示；丹参小檗碱桥酶基因smbbe3编码的氨基酸序列如seq id no:4所示。
14、本发明的再一目的在于提供：一种含有smbbe2和/或smbbe3丹参小檗碱桥酶基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、宿主细胞和/或工程菌。
15、作为优选的技术方案，所述表达载体为细菌、真菌或植物表达载体；所述宿主细胞为细菌、真菌或植物细胞。
16、本发明的再一目的在于提供：上述基因或上述生物材料的应用，所述应用为以下任意一种：
17、a：在催化丹酚酸e合成丹酚酸b中的应用；
18、b：制备转基因植物中的应用；
19、c：植物育种中的应用。
20、本发明的再一目的在于提供：丹参小檗碱桥酶smbbe2和/或smbbe3在催化丹酚酸e合成丹酚酸b中的应用。
21、本发明的再一目的在于提供：一种提高生物体内丹酚酸b含量的方法，将丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和/或smbbe3导入到生物体内，以获得过表达丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和/或smbbe3的生物体，进而生物体内丹酚酸b的含量得到提高。
22、本发明的再一目的在于提供：一种体外制备丹酚酸b的方法，采用丹参小檗碱桥酶smbbe2和/或smbbe3催化丹酚酸e生成丹酚酸b。
23、作为优选的技术方案，体外制备丹酚酸b的方法，反应体系如下：500μl反应体系中含有80-120mm ph为8.0的tris-hcl缓冲液，100-200μg纯化的蛋白，100-300μm底物丹酚酸e，80-120nm fad辅助因子，反应条件为25-30℃，150rpm，振荡反应2-4h后，加入等体积的甲醇终止反应。
24、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
25、本发明首次公开了丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和smbbe3，其所编码的丹参小檗碱桥酶smbbe2和smbbe3均能够催化丹酚酸e生成丹酚酸b，为大规模生产丹酚酸b提供了新途径，也为工业生产其它相关丹酚酸类化合物奠定课坚实的基础。
1.丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和smbbe3，其特征在于，所述基因smbbe2编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:3所示；所述基因smbbe3编码的蛋白质的氨基酸序列如seq idno:4所示。
2.根据权利要求1所述的丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和smbbe3，其特征在于，所述基因smbbe2的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述基因smbbe3的核苷酸序列如seq id no:2所示。
3.丹参小檗碱桥酶smbbe2和smbbe3，其特征在于，所述丹参小檗碱桥酶smbbe2的氨基酸序列如seq id no:3所示；所述丹参小檗碱桥酶smbbe3的氨基酸序列如seq id no:4所示。
4.一种含有权利要求1或2所述smbbe2和/或smbbe3丹参小檗碱桥酶基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、宿主细胞和/或工程菌。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述表达载体为细菌、真菌或植物表达载体；所述宿主细胞为细菌、真菌或植物细胞。
6.权利要求1或2所述基因或权利要求4所述生物材料的应用，其特征在于，所述应用为以下任意一种：
7.权利要求3所述的丹参小檗碱桥酶smbbe2和/或smbbe3在催化丹酚酸e合成丹酚酸b中的应用。
8.一种提高生物体内丹酚酸b含量的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和/或smbbe3导入到生物体内，以获得过表达丹参小檗碱桥酶基因smbbe2和/或smbbe3的生物体，进而生物体内丹酚酸b的含量得到提高。
9.一种体外制备丹酚酸b的方法，其特征在于，采用权利要求3所述的丹参小檗碱桥酶smbbe2和/或smbbe3催化丹酚酸e生成丹酚酸b。
10.根据权利要求9所述的体外制备丹酚酸b的方法，其特征在于，反应体系如下：500μl反应体系中含有80-120mm ph为8.0的tris-hcl缓冲液，100-200μg纯化的蛋白，100-300μm底物丹酚酸e，80-120nm fad辅助因子，反应条件为25-30℃，150rpm，振荡反应2-4h后，加入等体积的甲醇终止反应。
