本发明属于生物酶催化领域，具体涉及一种亚胺还原酶及利用该酶制备(s)-烟碱的方法。
背景技术：
1、烟碱是烟草制品的重要化学成分，其含量高低与烟草制品的品质和口感密切相关。天然烟碱(>99％、(s)-烟碱)主要来源于烟草植物，例如，烤烟和卷烟。目前以烟草植物叶提取的方法获得(s)-烟碱，但此法杂质多、纯度低、受地理环境因素影响大，并存在杂质难分离的问题。(s)-烟碱也可合成的方法获得主要有化学法和生物催化法两种方法。化学合成方法反应条件苛刻，需在高温、高压条件下多级反应，能耗较高且对反应器要求苛刻。生物催化合成(s)-烟碱具有效率高、立体选择性高、成本低、绿色环保等优势，近年来受到广泛关注。
2、虽然目前已有利用亚胺还原酶催化合成(s)-烟碱的报道，但是这些技术多以麦斯明为原料进行制备，需要先合成(s)-去甲烟碱，再将(s)-去甲烟碱进行甲基化反应得到(s)-烟碱，不仅反应步骤复杂，而且反应时间长，终产物(s)-烟碱的产率不高。此外，有相关研究表明，可以利用亚胺还原酶催化n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐一步合成(s)-烟碱，但是这些研究所应用的亚胺还原酶催化活性较差，反应时间长，获得的终产物(s)-烟碱的产率也不高。
3、因此，有必要提供一种高催化活性的亚胺还原酶，以提高(s)-烟碱的合成速度，提高产率。
技术实现思路
1、本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种高催化活性的亚胺还原酶及其突变体，以及利用该亚胺还原酶及其突变体催化n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐合成(s)-烟碱的方法。采用本发明方法，(s)-烟碱产率高，反应时间短，步骤简捷，生产成本低，污染小，对环境影响小，可实现(s)-烟碱的规模化生产。
2、本发明的目的通过下述技术方案实现：
3、一种亚胺还原酶ir-55，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、>seq id no.1
5、mntkqitiiglgqmgtklaellvakgytvsvwnrtrakgdsiagvkvfedveeavrqspli
6、vicvldyaavdhvldhisdksilggktlinfttadpqeaetlettlarisagyingaiqvapd
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8、ihgivlaqktglpldafseilgeitpgfteffkhqigvvekgdfrvsqsplsisiaatqrihhafrkagaqedfvkaisdllqkaeslgladqevaalvkvvg。
9、本发明还提供一种亚胺还原酶ir-55的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
10、>seq id no.2
11、atgaacaccaaacagattaccattatcggtctgggccagatgggcaccaaactggccga
12、actgctggttgccaaaggctataccgttagtgtgtggaatcgcacccgcgcaaaaggcg
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19、gggcaatcgcgccgcactggcaagcgcaatggatctggccaccctgacctggctgtatg
20、gcagttataccggtctgattcatggtattgtgctggcacagaaaaccggcctgccgctgg
21、atgcatttagtgaaattctgggtgaaattacacctggctttaccgaattttttaaacatca
22、gattggcgttgtggaaaaaggtgattttcgcgttagtcagagcccgttaagtattagtat
23、tgcagcaacccagcgcattcatcatgcatttcgcaaagcaggcgcacaggaagattttg
24、ttaaagcaattagtgatctgctgcagaaagcagaaagtctgggcctggccgatcaggaagtggcagcactggtgaaagttgttggt。
25、本发明还提供一种亚胺还原酶ir-55的突变体，包括ir-55-s233g和ir-55-s233g-c64a，其中突变体ir-55-s233g的氨基酸序列为：如seq id no.1所示氨基酸序列的第233位氨基酸由s突变为g，其他氨基酸残基保持不变；
26、突变体ir-55-s233g-c64a的氨基酸序列为：如seq id no.1所示氨基酸序列的第64位氨基酸由c突变为a，且第233位氨基酸由s突变为g，其他氨基酸残基保持不变。
27、本发明还提供一种含有上述的亚胺还原酶ir-55或其突变体的编码基因的重组载体或重组菌。
28、本发明还提供上述的亚胺还原酶或其突变体，重组载体或重组菌在催化n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐转化制备(s)-烟碱中的应用。
29、本发明还提供一种制备(s)-烟碱的方法，包括以下步骤：将n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐溶于tris-hcl缓冲液，将表达亚胺还原酶ir-55或其突变体的工程菌冻干粉、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和nadp+加入到tris-hcl缓冲液中，得到水相；调节ph值，于室温下搅拌反应；反应结束后用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物(s)-烟碱。
30、优选的，所述的表达亚胺还原酶ir-55或其突变体的工程菌冻干粉的构建方法为：将亚胺还原酶ir-55或其突变体的编码基因导入pet28a，酶切位点为ndei、ecori，得到重组质粒，然后将重组质粒导入e.coli bl21(de3)，即得。
31、优选的，所述的葡萄糖脱氢酶为glucose dehydrogenase(gdh)(cdx-901)fromcodexis，购自sigma。
32、优选的，所述的n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐、表达亚胺还原酶或其突变体的工程菌冻干粉、葡萄糖脱氢酶和葡萄糖的质量比为50:30:4:75；所述的葡萄糖与nadp+的质量比为10:1。
33、优选的，所述的tris-hcl缓冲液为0.1mol/l，ph＝8.5的tris-hcl缓冲液。
34、优选的，所述的调节ph值为调节ph至8.5，所述反应的反应时间为6h。
35、本发明具有以下有益效果：
36、本发明通过优化(s)-烟碱合成工艺中的催化酶、反应体系及ph的因素，以本发明人团队挖掘的新型亚胺还原酶r-55或其突变体作为催化酶，该酶对(s)-烟碱催化活力高、立体选择性好，可有效催化n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐转化为(s)-烟碱；以ph 8.5的tris-hcl缓冲液，能显著提高反应底物浓度，提高生物转化效率，缩短反应时间，最终在较短的反应时间(6h)内合成光学纯度ee值高达99.1％的(s)-烟碱，且产率为77％，转化率＞99.9％，显著优于现有的技术水平。
1.一种亚胺还原酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种权利要求1所述的亚胺还原酶的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，包括以下任一项所示的氨基酸序列：
4.一种含有权利要求1所述的亚胺还原酶的编码基因或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体的编码基因的重组载体或重组菌。
5.权利要求1所述的亚胺还原酶、权利要求3所述的亚胺还原酶突变体或权利要求4所述的重组载体或重组菌在催化n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐转化制备(s)-烟碱中的应用。
6.一种制备(s)-烟碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：将n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐溶于tris-hcl缓冲液，将表达权利要求1所述的亚胺还原酶或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体的工程菌冻干粉、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和nadp+加入到tris-hcl缓冲液中，得到水相；调节ph值，于室温下搅拌反应；反应结束后用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物(s)-烟碱。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的表达权利要求1所述的亚胺还原酶或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体的工程菌冻干粉的构建方法为：将权利要求1所述的亚胺还原酶或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体的编码基因导入pet28a，酶切位点为ndei、ecori，得到重组质粒，然后将重组质粒导入e.coli bl21(de3)，即得。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的n-甲基-[4-(吡啶-3-基)-4-氧代-丁基胺二盐酸盐、表达权利要求1所述的亚胺还原酶或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体的工程菌冻干粉、葡萄糖脱氢酶和葡萄糖的质量比为50:30:4:75；所述的葡萄糖与nadp+的质量比为10:1。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的tris-hcl缓冲液为0.1mol/l，
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的调节ph值为调节ph至8.5，所述反应的反应时间为6h。
