本发明涉及分子生物，尤其涉及一种产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法及应用。
背景技术：
1、l-赖氨酸是蛋白质的重要组分之一，是人体不能自身合成但又十分需要的八种氨基酸之一，主要用于人类医学、制药工业、食品工业等领域。由于l-赖氨酸的重要性，对于提高l-赖氨酸的产量的研究也持续进行。
2、l-赖氨酸通过谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)菌株的发酵产生，提高l-赖氨酸的产量的研究涉及到发酵技术，例如搅拌、供应氧气、改进培养基等方面，但是这种方式l-赖氨酸的产量提高量有限；还涉及到发酵过程中微生物的性能改变，例如诱变、选择和筛选突变体，微生物的性能改变过程中，对抗代谢物具有抗性，或使具有重要调节性能的代谢物形成营养缺陷。
3、授权公告号为cn 115038716 b的专利中公开了一种新abc转运蛋白atp结合蛋白变体及使用其生产l-赖氨酸的方法，但是并没有公开voc基因的改变是否影响l-赖氨酸的合成。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提出了一种产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法及应用，通过同源交换将突变后的voc基因，核苷酸序列如seq id no.1所示，替换谷氨酸棒杆菌atcc13032 voc基因，核苷酸序列如seq id no.2所示，得到谷氨酸棒杆菌dxmc013，其能够提高l-赖氨酸的产量。
2、本发明的技术方案是这样实现的：
3、通过紫外照射将谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）dxmc012进行诱变处理。将活化好的菌液离心，弃上清，菌体用生理盐水稀释至1×108cfu/ml（稀释10倍）；提前开启紫外灯预热30 min，将稀释好的菌液取3 ml涂布于一次性培养皿，于0、30、60、90、120 s紫外处理，每个梯度设置3组平行；紫外照射后用适当的稀释比例涂布平板进行菌落计数(避光培养)，绘制致死率曲线。选择致死率在80-90%的照射时间作为突变的照射时间。筛选l-赖氨酸产量提高的菌株，对其进行基因组测序，发现其voc产生突变，核苷酸序列如seq id no.1所示。以上启示，voc基因的改变可能提高谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸的能力。
4、本发明中，突变后voc基因片段上，第97-191核苷酸缺失，对应的第33-64氨基酸缺失。由于缺失的氨基酸不是3的倍数，第64位后面的氨基酸全部产生移码突变。
5、本发明中，谷氨酸棒杆菌dxmc012，分类命名：谷氨酸棒杆菌 corynebacterium glutamicum，保藏编号cctcc no：m20232577，保藏日期：2023年12月18日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。
6、通过上述启示，一方面，本发明提供了一种产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：
7、步骤一
8、以谷氨酸棒杆菌dxmc012突变菌株基因组dna为模板，pcr扩增突变后voc基因片段，核苷酸序列如 seq id no.1所示；
9、步骤二
10、以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组dna为模板，pcr扩增上游同源臂up核苷酸序列如 seq id no.3所示、下游同源臂down核苷酸序列如 seq id no.4所示。
11、本发明中，谷氨酸棒杆菌atcc 13032来源于美国模式培养物集存库，菌种编号atcc 13032。
12、步骤三
13、通过无缝克隆试剂盒将突变后voc基因片段与上游同源臂up、下游同源臂down连接，并插入线性化载体，制得重组质粒；
14、步骤四
15、将步骤三制得的重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌atcc 13032感受态细胞，筛选，即得谷氨酸棒杆菌dxmc013。
16、谷氨酸棒杆菌dxmc013，分类命名：谷氨酸棒杆菌 corynebacterium glutamicum，保藏编号cctcc no：m20232578，保藏日期：2023年12月18日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。
17、优选的，步骤二中，pcr扩增以谷氨酸棒杆菌atcc 13032的基因组dna为模板，获得上游同源臂up，pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
18、up-f: caggtcgactctagaggatccgtggtggacatggcttttcg seq id no.5；
19、up-r: caggatagaacacccctaagttcggttccctgg seq id no.6；
20、（本发明中，引物序列中存在大小写，为同源重组互补序列，包括部分酶切位点，下同）
21、pcr扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
22、2×phanta max master mix 25μl
23、up-f（10μmol/l） 2μl
24、up-r（10μmol/l） 2μl
25、模板 2μl
26、dd h2o 19μl；
27、pcr扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
28、优选的，步骤二中，pcr扩增以谷氨酸棒杆菌atcc 13032的基因组dna为模板，获得下游同源臂down，pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
29、down-f: cggagttctaggcagttctaagcgctccacg seq id no.7；
30、down-r: acgacggccagtgccgaattcccaagaagctctcgtagaattcg seq id no.8；
31、pcr扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
32、2×phanta max master mix 25μl
33、down-f（10μmol/l） 2μl
34、down-r（10μmol/l） 2μl
35、模板 2μl
36、dd h2o 19μl；
37、pcr扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
38、优选的，步骤一中，pcr扩增以谷氨酸棒杆菌dxmc012的基因组dna为模板，获得突变后voc基因片段，pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
39、voc-f: cttaggggtgttctatcctggcggcatg seq id no.9；
40、voc-r: tagaactgcctagaactccgcgatattgatcttc seq id no.10；
41、pcr扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
42、2×phanta max master mix 25μl
43、voc-f（10μmol/l） 2μl
44、voc-r（10μmol/l） 2μl
45、模板 2μl
46、dd h2o 19μl；
47、pcr扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
48、优选的，步骤三中，无缝克隆试剂盒中，多片段无缝克隆体系如下，总体系为10μl：
49、线性化载体pk19mobsacb 2μl
50、up 1μl
51、down 1μl
52、突变voc基因片段 1μl
53、2 × clonexpress mix 5μl
54、多片段无缝克隆程序如下：多片段重组反应，50℃，15 min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
55、优选的，步骤四中，谷氨酸棒杆菌atcc 13032感受态细胞制备步骤如下：
56、s1 挑取谷氨酸棒杆菌atcc 13032的单菌落，在种子培养基中培养至菌体浓度od600为0.7～0.9，置于冰上冷却至4℃，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得谷氨酸棒杆菌atcc 13032感受态细胞；
57、s2 将重组质粒高压电击转化至谷氨酸棒杆菌atcc 13032感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28～32℃培养12~16 h，筛选，即得谷氨酸棒杆菌dxmc013。
58、进一步优选的，种子培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、葡萄糖4～6g。
59、进一步优选的，电转缓冲液，每升组分包括如下成分：山梨醇85～96 g、甘露醇85～96 g、甘油95～105 ml。
60、进一步优选的，液体复苏培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96 g 、甘露醇65～73g。
61、进一步优选的，步骤s2中，高压电击转化的条件为：2200 v电击5 ms。
62、另一方面，本发明还提供了谷氨酸棒杆菌dxmc013在产l-赖氨酸中的应用。
63、本发明的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法相对于现有技术具有以下有益效果：
64、谷氨酸棒杆菌dxmc013相对于原始菌谷氨酸棒杆菌atcc 13032，能够明显提高l-赖氨酸的产量和生长速度快，节约发酵时间和成本，并且可以减少染菌几率。
1.一种产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，pcr扩增突变后voc基因片段时，pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
3.如权利要求1所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，pcr扩增上游同源臂up时，pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
4.如权利要求1所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，pcr扩增下游同源臂down时，pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
5.如权利要求1所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤三的无缝克隆试剂盒中，多片段无缝克隆体系如下，总体系为10μl：
6.如权利要求1所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤四中，谷氨酸棒杆菌atcc 13032感受态细胞的制备步骤如下：
7.如权利要求6所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述种子培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、葡萄糖4～6g。
8.如权利要求6所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述电转缓冲液，每升组分包括如下成分：山梨醇85～96 g、甘露醇85～96 g、甘油95～105 ml。
9.如权利要求6所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述液体复苏培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96 g、甘露醇65～73g。
10.权利要求1-9任一项所述的产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法制得的谷氨酸棒杆菌dxmc013在产l-赖氨酸中的应用。
