本发明属于细胞，具体涉及一种全眼球单细胞悬液及其制备方法。
背景技术：
1、眼球是眼的核心结构，由眼球壁和眼内容物构成。眼球壁包括纤维膜(角膜、巩膜)，血管膜(脉络膜、睫状体、虹膜)和视网膜；眼球内容物包括晶状体、玻璃体以及房水[1]。随着基因和细胞功能研究的逐渐深入，基因诊断与治疗在眼科疾病中的使用日益广泛。部分眼部疾病(如白内障、青光眼、近视等)被发现与特定的基因变异与基因多态性密切相关，一些相关的基因标志物已被用于眼部疾病的预测与诊断[2]。
2、目前，为提高对眼部疾病的理解，二代测序技术被广泛应用于眼组织及相关疾病的研究中，通过对健康人群及患病人群眼部组织进行测序，可以提供含有丰富信息的对照图谱以供后续研究参考[3]。
3、单细胞测序技术在眼科研究中有非常广阔的前景，它与传统测序技术将组织中不同细胞当成整体处理不同，其可获得单个细胞水平上的转录组及蛋白组信息。通过对眼组织进行单细胞测序分析，可以获得不同细胞类型单个细胞维度下的丰富信息，从而更好地理解眼部疾病发病机制，并为眼部疾病治疗研究提供新的思路。眼部单细胞测序对干细胞研究，特别是眼球发育过程中细胞的示踪以及细胞亚群的分析、干细胞标志物的分析、干细胞调控机制等已展现了非常好的应用场景，如部分高度表达干细胞标志物的细胞就通过单细胞测序被发现，为眼干细胞工程的发展及靶向治疗方法开发奠定基础[4]。其次，眼部单细胞测序在遗传病的诊断及治疗，眼睛损伤后的病理，生理过程的精确描述，包括一些其它眼组织损伤后的干细胞调控机制等方面有待进一步研究。眼部单细胞测序能够探索与某些眼部疾病相关的特定细胞类型和生物标志物，一方面有助于科学家深入得认识疾病的病理生理过程，另一方面也可以对疾病的治疗提供新的路径。
4、由于眼球结构复杂，包含玻璃体等黏度较大的组分，在保证细胞总数与细胞活率的前提下，如何平衡不同组织间的消化条件富有挑战，现有的眼部组织单细胞悬液的制备方法主要集中于单个眼球组分而非将眼球作为一个整体。对眼部组织单个组分进行单细胞悬液制备需要对目标组织进行手术分离，其过程操作繁杂，如在视网膜的单细胞测序研究中需要对视网膜进行手术剥离，其步骤包括对眼球的物理固定，前眼段的去除，晶状体及玻璃体的取出，和视网膜神经层的剥离[5]。此外由于眼部结构复杂精细，将单个组分进行手术分离，难以保证眼球组分的完整性，从而导致后续研究重要信息的缺失。
5、将眼球不同结构同时进行分析有利于找出不同结构之间的相互作用，拓宽分析广度，开发适用于全眼单细胞悬液制备的方法很有必要。目前，为减少人工操作带来的误差，使用自动组织处理器代替人工已经成为主流。然而现有机器(例如gentlemacs全自动组织处理器)自带程序均不适用于全眼解离，获得的单细胞悬液不能满足单细胞测序的上机要求，如细胞结团率过高、回收细胞数不足等。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中难以保证眼球组分完整性、细胞结团率过高、回收率不足的缺陷，提供一种全眼球单细胞悬液及其制备方法。本发明的方法获得的单细胞悬液细胞总数量较多、细胞活率较高，为单细胞测序提供符合上机要求的全眼球单细胞悬液。
2、本发明创新性地设计了能够保证单细胞测序上机要求(包括细胞活率，细胞数，结团率，直径分布等)的单细胞悬液制备方法。首先，该方法既消除了对精确组织解剖的需求，节约大量操作时间，大大减小了复杂操作带来的人工误差，又可以更好地适用于大批量样本的制备。其次，本发明创新性地优化了消化酶体系和死细胞去除步骤。在消化酶体系中，直接使用商用酶反应体系无法进行全眼球组织解离。在细胞量低于商用死细胞去除反应体系设定的单次用量时，死细胞去除不但没效果，且在死细胞去除步骤后细胞大量死亡，细胞活率下降，不能满足实验要求，因此发明人采用等比例增减dead cell removalmicrobeads的使用量的方法优化此步骤，解决了当细胞回收率及活率不足时全眼球组织解离的问题。此外，本发明自主设计的解离程序解决了眼球组织细胞粘性大地问题。
3、本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题。
4、本发明的第一方面提供一种全眼球单细胞悬液的制备方法，所述方法包括：
5、将用酶反应体系处理后的全眼球碎片样本置于全自动组织处理器上进行组织解离；
6、其中，所述酶反应体系使用multi tissue dissociation kit 2中的酶，酶p、酶a与酶d的工作体积比为(5～6)∶1∶(8～10)；所述组织解离在37℃下进行，以20rpm逆时针旋转10s后静置10分钟为一个循环，共三个循环。
7、本发明一些实施方案中，所述酶反应体系使用multi tissue dissociationkit 2中的酶，酶p、酶a与酶d的工作体积比为5∶1∶8。
8、本发明一些较佳实施方案中，所述酶反应体系使用multi tissue dissociationkit 2中的缓冲液；所述缓冲液中，buffer x与buffer y的工作体积比为92∶1。
9、本发明一些实施方案中，所述制备方法还包括在所述组织解离结束后通过终止液终止反应的步骤。
10、本发明一些较佳实施方案中，所述终止液为含10％(v/v)fbs的无ca2+mg2+pbs。
11、本发明一些实施方案中，所述制备方法还包括在终止反应后通过裂红液裂解细胞悬液中红细胞的步骤。
12、本发明一些实施方案中，所述方法还包括在所述全眼球单细胞悬液中细胞活率小于等于80％时进行死细胞去除；
13、所述细胞活率为活细胞浓度占总细胞浓度的比例；所述总细胞浓度为活细胞浓度与死细胞浓度之和。
14、本发明一些较佳实施方案中，所述死细胞去除使用美天旎dead cell removalkit(130-090-101)进行；其中，dead cell removal micro beads的使用量为8～10μl deadcell removal microbeads/1×106cell。
15、本发明一些具体实施方案中，dead cell removal microbeads的使用量为10μldead cell removal microbeads/1×106 cell。
16、本发明一些实施方案中，所述全眼球碎片样本通过以下方式制备：
17、在组织培养基中移除待处理的全眼球样本的多余组织，并用pbs缓冲液冲洗干净后人工破碎。
18、本发明中，所述组织培养基可为本领域常规组织培养基，优选地为无血清dmem培养基。
19、本发明的第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括酶反应体系，所述酶反应体系使用multi tissue dissociation kit 2中的酶，酶p、酶a与酶d的工作体积比为(5～6)∶1∶(8～10)。
20、本发明一些具体实施方案中，酶p、酶a与酶d的工作体积比为5∶1∶8。
21、本发明一些较佳实施方案中，所述酶反应体系使用multi tissue dissociationkit2中的缓冲液；所述缓冲液中，buffer x与buffery的工作体积比为92∶1。
22、本发明一些实施方案中，所述试剂盒还包括终止液，所述终止液优选为含10％(v/v)fbs的无ca2+mg2+pbs。
23、本发明一些实施方案中，所述试剂盒还包括裂红液。
24、本发明一些实施方案中，所述试剂盒还包括样本处理液，所述样本处理液优选地为pbs。
25、本发明的第三方面还提供一种制备全眼球细胞悬液的系统，所述系统包括酶反应模块和组织解离模块；所述酶反应模块对全眼球碎片样本进行消化，并由组织解离模块对消化后的全眼球碎片样本进行组织解离。
26、本发明一些实施方案中，所述酶反应模块通过酶反应体系对全眼球碎片样本进行消化，所述酶反应体系如本发明第一方面所述。
27、本发明一些实施方案中，所述组织解离模块通过全自动组织处理器进行组织解离，所述组织解离如本发明第一方面所述。
28、本发明的一些实施方案中，所述系统还包括反应终止模块；所述反应终止模块终止所述组织解离的反应，得到细胞悬液。
29、本发明一些较佳实施方案中，所述反应终止模块通过终止液终止所述反应，所述终止液如本发明第一方面所述。
30、本发明一些实施方案中，所述系统还包括预处理模块。
31、本发明一些较佳实施方案中，所述预处理模块通过对样本进行清洁得到所述全眼球碎片样本。
32、本发明中，所述清洁指去除置于组织培养基中所述样本的周围组织，并通过样本处理液冲洗干净。所述组织培养基例如为无血清dmem培养基。所述样本处理液例如为pbs缓冲液。
33、本发明一些实施方案中，所述系统还包括后处理模块，所述后处理模块对所述反应终止模块终止反应后得到的细胞悬液进行纯化处理。
34、本发明一些较佳实施方案中，所述后处理模块对所述反应终止模块终止反应后得到的细胞悬液进行裂红处理。
35、本发明的第四方面提供一种全眼球单细胞悬液，所述全眼球单细胞悬液由如第一方面所述的制备方法制得。
36、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
37、本发明所用试剂和原料均市售可得。
38、本发明的积极进步效果在于：
39、1)本发明首次提供一种针对全眼组织的单细胞悬液制备方法，为全眼单细胞测序研究提供符合上机要求的样本。
40、2)本发明创新性开发了组织解离程序，优化眼球组织解离酶体系及死细胞去除步骤，有效解决了眼球组织黏性大、细胞结团率高、细胞回收率及活率较低等问题。
41、3)本发明所述方法无需对眼球内各部分组织进行手术分离，大大减少人工操作占比，在缩短操作时间的基础上，减少眼球内细胞因离体时间过长导致的死亡，提高样本活率。同时，本发明明确实验体系和时间，便于研究人员操作，同时降低人工导致的实验偏差，使得方法具有较优的重现性。
42、4)本发明所述方法操作简便，耗时短，仅需较少起始样本，即可获得大量高活率细胞，具有良好的实际应用价值。
43、综上，本发明方法获得的全眼单细胞悬液总细胞活率高、结团率低、质量稳定、耗费样本量少、获得的单细胞悬液总细胞数量较多、且降低了人为偏差导致实验批次效应，为后续眼球单细胞测序研究提供高质量样本，加速眼组织细胞异质性情况、眼部疾病标志物及靶点发现的探索，为眼球各组织发育过程的阐述，疾病机理探索及新型治疗方案的发现提供技术支撑。
1.一种全眼球单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在所述组织解离结束后通过终止液终止反应的步骤；
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
4.如权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，
5.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述全眼球碎片样本通过以下方式制备：
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶反应体系，所述酶反应体系使用multitissue dissociation kit2中的酶，酶p、酶a与酶d的工作体积比为(5～6)∶1∶(8～10)；例如5∶1∶8；
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂红液；
8.一种制备全眼球单细胞悬液的系统，其特征在于，所述系统包括酶反应模块和组织解离模块；所述酶反应模块对全眼球碎片样本进行消化，并由组织解离模块对消化后的全眼球碎片样本进行组织解离；
9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述系统还包括反应终止模块；所述反应终止模块终止所述组织解离的反应，得到细胞悬液；和/或，所述系统还包括预处理模块；
10.一种全眼球单细胞悬液，其特征在于，所述全眼球单细胞悬液由如权利要求1～5任一项所述的制备方法制得。
