本技术属于生物，具体涉及生物工程以及生物催化领域，进一步而言，涉及通过嗜热酶催化反应制备化合物的方法以及通过该方法制备n-乙酰神经氨酸、组合物、用途和筛选方法，尤其涉及使用需钠弧菌作为底盘生物，通过嗜热酶催化合成n-乙酰神经氨酸。
背景技术：
1、需钠弧菌是目前生长最快的细菌，它的倍增时间小于10分钟。而且它的遗传背景清晰，遗传操作工具和蛋白表达系统研究的已经非常透彻。鉴于其快速生长、快速底物摄取、快速蛋白表达等优良特性，需钠弧菌被认定为下一代工业技术应用底盘。目前，使用需钠弧菌作为底盘细胞已经实现了1,3-丙二醇、丙氨酸、2,3-丁二醇等化合物的合成。除此之外，由于其可以进行蛋白质快速、可溶性表达，需钠弧菌在生物酶催化领域也具有巨大的潜力。
2、酶催化可以看作在酶的表面吸附了反应物或者是酶与反应物形成了中间化合物后进行反应的过程。酶催化技术是将酶或者微生物细胞、细胞器等在一定的生物反应装置中,利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成生物活性物质、高附加值化合物或其他精细化学品的技术。近几十年来,随着酶工程不断的技术性突破,酶催化技术在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。
3、n-乙酰神经氨酸(neu5ac)是最常见的一种唾液酸。它可以促进婴儿的大脑发育，提高免疫力，作为抗癌抗病毒的药物，也可以作为保健品食用，是一种非常重要的化合物。目前，n-乙酰神经氨酸(neu5ac)已经被世界上许多国家认证为食品和保健品可添加的成分，并且也已经通过fda的认证。随着n-乙酰神经氨酸(neu5ac)适用范围和市场需求的进一步扩大，需要进一步开发更加经济有效的方法进行neu5ac的合成。
4、目前，n-乙酰神经氨酸的合成方法主要有直接提取法、化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。直接从天然来源的材料如鸡冠、鸡蛋中提取n-乙酰神经氨酸的含量通常比较低，提取纯化的过程又比较复杂，不适宜大批量生产。化学合成法通常发生在碱性条件下(ph>10.5)，通过glcnac和草酰乙酸缩合然后脱羧。这个过程需要大量的氢氧化钠或者氢氧化钙提供碱性环境造成环境的污染，同时也会产生其他的中间产物和同分异构体，不利于工业化的生产。微生物发酵法生产n-乙酰神经氨酸可以以廉价的碳源如葡萄糖、甘油等为底物通过代谢工程改造来实现，而且不需要额外添加昂贵的辅因子是一种经济有效的方法，但目前产量仍比较低，还没有达到工业化生产的水平。
5、在neu5ac的生产过程中酶催化法以n-乙酰葡萄糖胺为底物通过n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶(n-acetyl-d-glucosamine2-epimerase,age)催化生成n-乙酰甘露糖胺，随后n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸在n-乙酰神经氨酸裂解酶(n-acetyl-neuraminate lyase,nana)的催化作用下合成neu5ac。目前研究学者已经在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等常见的底盘生物中催化合成了n-乙酰神经氨酸。但是目前报道的合成neu5ac的酶催化体系生产效率还不够高，蛋白质诱导表达以及催化的时间较长，催化反应一般在30℃或者37℃下进行，反应速度受到限制。此外在温度接近菌株培养条件下进行催化，胞内本底的酶活性较高，因此副途径代谢比较活跃存在丙酮酸溢流、n-乙酰神经氨酸合成再利用以及n-乙酰葡萄糖胺的利用问题，与n-乙酰神经氨酸合成途径竞争，不利于产物的积累。
技术实现思路
1、为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了通过嗜热酶催化反应制备化合物的方法以及通过该方法制备n-乙酰神经氨酸的方法、组合物、用途和筛选方法，尤其涉及使用需钠弧菌作为底盘生物，通过嗜热酶催化合成n-乙酰神经氨酸。
2、具体而言，本发明提供了：
3、(1)一种酶催化制备化合物的方法，该方法包括以下步骤：
4、1)确定需要合成的化合物；
5、2)确定所述化合物合成途径的关键酶；
6、3)选定一种氨基酸序列的所述关键酶作为模板进行相同功能的耐高温酶的挖掘；
7、4)构建催化酶的表达载体，其中所述催化酶选自模板酶和耐高温酶中的一种或多种；
8、5)将表达载体导入宿主微生物细胞；
9、6)诱导蛋白质合成；
10、7)建立高温催化体系，催化合成所述化合物；
11、其中，所述催化酶的反应温度范围为大于等于42℃且小于等于85℃；所述的宿主微生物细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、需钠弧菌，优选需钠弧菌；所述的化合物分解点不低于42℃。
12、(2)根据(1)所述的方法，其中所述催化酶为来自于同一种或不同种微生物的重组酶，包括一种酶或多种酶，其特征在于所述酶的gc含量大于60％。
13、(3)根据(1)所述的方法，其中所述宿主微生物细胞包括一种或多种宿主微生物细胞。
14、(4)根据(1)所述的方法，其中所述化合物经过一种酶或多种酶催化反应制备，所述化合物包括neu5ac、左旋多巴、磷酯酰丝氨酸。
15、(5)一种通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的方法，该方法
16、包括以下步骤：
17、1)以n-乙酰葡萄糖胺为底物在n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的催化作用下生成n-乙酰甘露糖胺；以及
18、2)以所述n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物在n-乙酰神经氨酸裂解酶的催化作用下生成所述n-乙酰神经氨酸；
19、其中所述步骤1)和/或所述步骤2)的反应温度范围分别为大于等于42℃且小于等于85℃。
20、(6)根据(5)所述的方法，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶为源自第一微生物的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶为源自第二微生物的重组n-乙酰神经氨酸裂解酶；其中所述第一微生物包括厦门嗜热菌(thermophagus xiamenensis)，所述第二微生物包括：大肠杆菌(escherichia coli)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、古热球菌(thermococci archaeon)、斯坦西摩尔氏菌(moorella stamsii)、古热浆菌(thermoplasmata archaeon)、热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)、摩尔氏菌(moorella sp.e308f)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、浮霉菌(planctomycetes bacteriumeta_a1)、嗜斜热球菌(thermococcus barophilus)、丰氏热厌氧单胞菌(thermanaeromonas toyohensis)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobiumfaecavium)和热球菌(thermococcus sp.pk)；
21、优选地，所述第二微生物选自：大肠杆菌(escherichia coli)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobium faecavium)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)和热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)。
22、(7)根据(5)所述的方法，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；其中所述n-乙酰神经氨酸裂解酶的氨基酸序列如seq id no.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所示。
23、(8)根据(5)所述的方法，其中所述步骤1)和/或所述步骤2)的反应时间范围分别为1-36小时，优选为1-24小时，更优选为1-4小时。
24、(9)根据(5)所述的方法，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶是通过第一表达载体在第一宿主细胞中表达的，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶是通过第二表达载体在第二宿主细胞中表达的；其中所述第一表达载体与所述第二表达载体相同或不同，并且/或者所述第一宿主细胞与所述第二宿主细胞相同或不同；优选地，所述第一表达载体与所述第二表达载体相同，并且所述第一宿主细胞与所述第二宿主细胞相同。
25、(10)根据(9)所述的方法，其中通过所述第一表达载体在所述第一宿主细胞中表达的所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶未经过与所述第一宿主细胞分离而参与所述步骤1)，或者该n-乙酰-n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶经过与所述第一宿主细胞分离并纯化后参与所述步骤1)；其中通过所述第二表达载体在所述第二宿主细胞中表达的所述n-乙酰神经氨酸裂解酶未与所述第二宿主细胞分离而参与所述步骤2)，或者该n-乙酰神经氨酸裂解酶经过与所述第二宿主细胞分离并纯化后参与所述步骤2)。
26、(11)根据(9)所述的方法，其中所述宿主细胞包括细菌和真菌；优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、需钠弧菌，优选需钠弧菌；优选地，所述真菌包括酵母菌、链霉菌，优选酵母菌。
27、(12)一种用于通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的蛋白组合物，其中所述蛋白组合物包括n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶和n-乙酰神经氨酸裂解酶；其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-70℃，更优选50-65℃，更优选60-65℃下具有催化n-乙酰葡萄糖胺生成n-乙酰甘露糖胺的活性；和/或所述n-乙酰神经氨酸裂解酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-80℃，更优选50-80℃，更优选60-80℃下具有催化n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成所述n-乙酰神经氨酸的活性。
28、(13)根据(12)所述的蛋白组合物，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶为源自第一微生物的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶为源自第二微生物的重组n-乙酰神经氨酸裂解酶；其中所述第一微生物包括厦门嗜热菌(thermophagus xiamenensis)，所述第二微生物包括：大肠杆菌(escherichia coli)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、古热球菌(thermococci archaeon)、斯坦西摩尔氏菌(moorella stamsii)、古热浆菌(thermoplasmata archaeon)、热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)、摩尔氏菌(moorella sp.e308f)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、浮霉菌(planctomycetes bacterium eta_a1)、嗜斜热球菌(thermococcus barophilus)、丰氏热厌氧单胞菌(thermanaeromonas toyohensis)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobiumfaecavium)和热球菌(thermococcus sp.pk)；
29、优选地，所述第二微生物选自：大肠杆菌(escherichia coli)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobium faecavium)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)和热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)。
30、(14)根据(12)所述的蛋白组合物，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；其中所述n-乙酰神经氨酸裂解酶的氨基酸序列如seq idno.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所示。
31、(15)根据(12)所述的蛋白组合物，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶是通过第一表达载体在第一宿主细胞中表达的，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶是通过第二表达载体在第二宿主细胞中表达的，其中所述第一表达载体与所述第二表达载体相同或不同，并且/或者所述第一宿主细胞与所述第二宿主细胞相同或不同。
32、(16)源自第一微生物的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶在通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的方法中的用途，其中所述重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-70℃，更优选50-65℃，更优选60-65℃下具有催化n-乙酰葡萄糖胺生成n-乙酰甘露糖胺的活性。
33、(17)根据(16)所述的用途，其中所述第一微生物包括厦门嗜热菌(thermophagusxiamenensis)；优先地，所述重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。
34、(18)源自第二微生物的重组n-乙酰神经氨酸裂解酶在通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的方法中的用途，其中所述重组n-乙酰神经氨酸裂解酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-80℃，更优选50-80℃，更优选60-80℃下具有催化n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成所述n-乙酰神经氨酸的活性。
35、(19)根据(18)所述的用途，其中所述第二微生物包括：大肠杆菌(escherichiacoli)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、古热球菌(thermococci archaeon)、斯坦西摩尔氏菌(moorella stamsii)、古热浆菌(thermoplasmata archaeon)、热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)、摩尔氏菌(moorella sp.e308f)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、浮霉菌(planctomycetes bacteriumeta_a1)、嗜斜热球菌(thermococcus barophilus)、丰氏热厌氧单胞菌(thermanaeromonas toyohensis)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobiumfaecavium)和热球菌(thermococcus sp.pk)；
36、优选地，所述第二微生物选自：大肠杆菌(escherichia coli)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobium faecavium)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)和热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)；
37、优选地，所述重组n-乙酰神经氨酸裂解酶的氨基酸序列如seq id no.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所示。
38、(20)一种筛选嗜热酶的方法，其中所述方法包括：
39、a)提供具有目标酶反应功能的参考酶的氨基酸序列；
40、b)将所述的参考酶的氨基酸序列输入嗜热酶筛选网站，优选网址为cem.sjtu.edu.cn的网站，设置筛选条件为微生物最适生长温度高于42℃，在输出结果中选择与所述参考酶的氨基酸序列的同源性大于20％的酶作为第一候选嗜热酶；优选地，选择与所述参考酶的氨基酸序列的同源性最高的至多一百种酶作为第一候选嗜热酶，并且所述第一候选嗜热酶彼此间的氨基酸序列同源性小于90％；可选地，限定所述第一候选嗜热酶的gc含量大于60％；
41、c)对所述第一候选嗜热酶进行蛋白质结构预测；
42、d)根据所述第一候选嗜热酶的蛋白质结构预测结果，计算并得到所述第一候选嗜热酶与所述目标酶反应中的底物分子对接的最小自由能；
43、e)根据所述第一候选嗜热酶的蛋白质结构预测结果，计算得到所述第一候选嗜热酶的稳定性数值；
44、f)根据所述第一候选嗜热酶的蛋白质结构预测结果，计算并得到所述第一候选嗜热酶的溶解性数值；
45、g)将所述步骤d)-f)分别得到的结果的数值进行归一化处理，并进行加和，将所得的加和结果进行排序，选择加和总和最小的十种所述第一候选嗜热酶，得到第二候选嗜热酶；优选地，对所述第二候选嗜热酶进行不同温度条件下的催化性能验证。
46、(21)根据(20)所述的方法，其中所述方法进一步包括：h)将所述第二候选嗜热酶进行系统进化树分析。
47、(22)一种表达载体，其含有可操作连接的且不按序连接的n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的编码序列和n-乙酰神经氨酸裂解酶的编码序列，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的编码序列和所述n-乙酰神经氨酸裂解酶的编码序列在同一启动子控制之下，或分别在各自的启动子控制之下；其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-70℃，更优选50-65℃，更优选60-65℃下具有催化n-乙酰葡萄糖胺生成n-乙酰甘露糖胺的活性；和/或所述n-乙酰神经氨酸裂解酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-80℃，更优选50-80℃，更优选60-80℃下具有催化n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成所述n-乙酰神经氨酸的活性。
48、(23)根据(22)所述的表达载体，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶为源自第一微生物的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶为源自第二微生物的重组n-乙酰神经氨酸裂解酶；其中所述第一微生物包括厦门嗜热菌(thermophagus xiamenensis)，所述第二微生物包括：大肠杆菌(escherichia coli)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、古热球菌(thermococci archaeon)、斯坦西摩尔氏菌(moorella stamsii)、古热浆菌(thermoplasmata archaeon)、热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)、摩尔氏菌(moorella sp.e308f)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、浮霉菌(planctomycetes bacterium eta_a1)、嗜斜热球菌(thermococcus barophilus)、丰氏热厌氧单胞菌(thermanaeromonas toyohensis)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobiumfaecavium)和热球菌(thermococcus sp.pk)；
49、优选地，所述第二微生物选自：大肠杆菌(escherichia coli)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobium faecavium)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)和热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)；
50、优选地，所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述n-乙酰神经氨酸裂解酶的氨基酸序列如seq id no.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所示。
51、(24)一种宿主细胞，其含有根据(22)或(23)所述的表达载体。
52、本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
53、将嗜热酶在合适的底盘细胞中重组表达，使用包含成功过表达嗜热酶的重组菌株构建高温条件下的细胞催化体系。将常温条件下生长的底盘细胞和高温的反应条件相结合，高温条件可以大大提高反应速率实现化合物的快速高效合成。此外，高温条件有利于细胞膜通透性增加乃至破裂，利于酶分子溢出参与反应，打破了产率的制约因素；而且高温条件可以抑制细胞本身代谢途径酶的活性，可使其代谢通路失活从而大大降低副反应的发生。
54、合成生物学底盘细胞需要具备遗传背景清晰、基因操作工具完备、操作简单等特性，从而实现高效、精准的遗传操作。常见的底盘细胞包括细菌和真菌类微生物，如广泛使用的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、需钠弧菌、酵母菌、链霉菌等。除了底盘细胞具备的上述优良特性外，需钠弧菌还具有生长速度快的优势。其倍增时间小于10分钟，是目前生长最快的细菌。使用需钠弧菌作为底盘细胞，可以大大提高生物合成的速率，缩短反应时间，降低生产成本。除此之外，需钠弧菌和大肠杆菌相比，可以实现蛋白质更加高效表达的同时保持高可溶性，因此可以作为生物催化的底盘实现化合物快速高效地合成化合物。
55、另一方面，本发明发现的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶和重组n-乙酰神经氨酸裂解酶在大于等于42℃且小于等于85℃下具有催化活性。所述重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶能够高效地催化n-乙酰葡萄糖胺生成n-乙酰甘露糖胺；所述重组n-乙酰神经氨酸裂解酶也能够高效地催化n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成n-乙酰神经氨酸。因此，在本发明的方法中，在反应体系中选用所述重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶和/或所述重组n-乙酰神经氨酸裂解酶，可使通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的方法得以高效地进行。由此使得本发明的产品和方法具有高效、稳定、环保、易于生产、成本低的优点，为n-乙酰神经氨酸的工业化生产提供了基础，具有广阔的应用前景。
56、由于所述重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶和所述重组n-乙酰神经氨酸裂解酶在高温下具有催化活性，因此热稳定性高，使得在进一步的发明中，可以使酶催化反应在高温条件下进行，从而进一步提高反应速率，缩短反应周期，降低成本。
57、在进一步的发明中，所述重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶和所述重组n-乙酰神经氨酸裂解酶可以通过表达载体在同一宿主细胞中表达。表达的酶无需与宿主细胞分离，就可参与通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的过程，从而可以避免辅因子atp的添加，降低生产成本。当酶催化反应的温度高于宿主细胞的培养温度时，还能够大大减少宿主细胞本身的副反应的发生。此外在高温下使用本发明的酶进行催化合成可以使细胞本身的酶失活，从而减少副产物的产生，并且降低产物被细胞内分解代谢基因进一步利用的可能性。同时，高温环境会破坏细胞结构，从而有利于本发明的嗜热酶释放，促进酶和底物的接触，进而有利于反应的进行。因此，使用本发明的嗜热酶进行neu5ac的催化合成可以提高反应速率、缩短反应时间、降低生产成本、减少副产物的生成。
58、在进一步的发明中，本发明还通过特别的挖掘/筛选分别得到了具有较高的酶催化活性的且稳定性高的源自第一嗜热微生物的n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶和源自第二嗜热微生物的n-乙酰神经氨酸裂解酶，并通过基因工程进行了重组。
59、在进一步的发明中，本发明还各自独立地优化了反应条件或反应影响因素，包括反应温度、反应时间、重组蛋白的表达条件、纯化程度等。从而使得通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的方法的反应效果进一步得到加强，包括进一步加快反应速率、减少副反应的发生、简化操作以及降低生物催化的成本等。
1.一种酶催化制备化合物的方法，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化酶为来自于同一种或不同种微生物的重组酶，包括一种酶或多种酶，其特征在于所述酶的gc含量大于60％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主微生物细胞包括一种或多种宿主微生物细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物经过一种酶或多种酶催化反应制备，所述化合物包括neu5ac、左旋多巴、磷酯酰丝氨酸。
5.一种通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的方法，该方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶为源自第一微生物的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶为源自第二微生物的重组n-乙酰神经氨酸裂解酶；其中所述第一微生物包括厦门嗜热菌(thermophagus xiamenensis)，所述第二微生物包括：大肠杆菌(escherichia coli)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、古热球菌(thermococci archaeon)、斯坦西摩尔氏菌(moorella stamsii)、古热浆菌(thermoplasmata archaeon)、热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)、摩尔氏菌(moorella sp.e308f)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、浮霉菌(planctomycetes bacteriumeta_a1)、嗜斜热球菌(thermococcus barophilus)、丰氏热厌氧单胞菌(thermanaeromonas toyohensis)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobiumfaecavium)和热球菌(thermococcus sp.pk)；
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；其中所述n-乙酰神经氨酸裂解酶的氨基酸序列如seq id no.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所示。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述步骤1)和/或所述步骤2)的反应时间范围分别为1-36小时，优选为1-24小时，更优选为1-4小时。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶是通过第一表达载体在第一宿主细胞中表达的，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶是通过第二表达载体在第二宿主细胞中表达的；其中所述第一表达载体与所述第二表达载体相同或不同，并且/或者所述第一宿主细胞与所述第二宿主细胞相同或不同；优选地，所述第一表达载体与所述第二表达载体相同，并且所述第一宿主细胞与所述第二宿主细胞相同。
10.根据权利要求9所述的方法，其中通过所述第一表达载体在所述第一宿主细胞中表达的所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶未经过与所述第一宿主细胞分离而参与所述步骤1)，或者该n-乙酰-n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶经过与所述第一宿主细胞分离并纯化后参与所述步骤1)；其中通过所述第二表达载体在所述第二宿主细胞中表达的所述n-乙酰神经氨酸裂解酶未与所述第二宿主细胞分离而参与所述步骤2)，或者该n-乙酰神经氨酸裂解酶经过与所述第二宿主细胞分离并纯化后参与所述步骤2)。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述宿主细胞包括细菌和真菌；优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、需钠弧菌，优选需钠弧菌；优选地，所述真菌包括酵母菌、链霉菌，优选酵母菌。
12.一种用于通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的蛋白组合物，其中所述蛋白组合物包括n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶和n-乙酰神经氨酸裂解酶；其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-70℃，更优选50-65℃，更优选60-65℃下具有催化n-乙酰葡萄糖胺生成n-乙酰甘露糖胺的活性；和/或所述n-乙酰神经氨酸裂解酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-80℃，更优选50-80℃，更优选60-80℃下具有催化n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成所述n-乙酰神经氨酸的活性。
13.根据权利要求12所述的蛋白组合物，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶为源自第一微生物的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶为源自第二微生物的重组n-乙酰神经氨酸裂解酶；其中所述第一微生物包括厦门嗜热菌(thermophagus xiamenensis)，所述第二微生物包括：大肠杆菌(escherichia coli)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、古热球菌(thermococci archaeon)、斯坦西摩尔氏菌(moorella stamsii)、古热浆菌(thermoplasmata archaeon)、热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)、摩尔氏菌(moorella sp.e308f)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、浮霉菌(planctomycetes bacterium eta_a1)、嗜斜热球菌(thermococcus barophilus)、丰氏热厌氧单胞菌(thermanaeromonas toyohensis)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobiumfaecavium)和热球菌(thermococcus sp.pk)；
14.根据权利要求12所述的蛋白组合物，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；其中所述n-乙酰神经氨酸裂解酶的氨基酸序列如seq idno.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所示。
15.根据权利要求12所述的蛋白组合物，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶是通过第一表达载体在第一宿主细胞中表达的，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶是通过第二表达载体在第二宿主细胞中表达的，其中所述第一表达载体与所述第二表达载体相同或不同，并且/或者所述第一宿主细胞与所述第二宿主细胞相同或不同。
16.源自第一微生物的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶在通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的方法中的用途，其中所述重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-70℃，更优选50-65℃，更优选60-65℃下具有催化n-乙酰葡萄糖胺生成n-乙酰甘露糖胺的活性。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述第一微生物包括厦门嗜热菌(thermophagusxiamenensis)；优先地，所述重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。
18.源自第二微生物的重组n-乙酰神经氨酸裂解酶在通过酶催化反应制备n-乙酰神经氨酸的方法中的用途，其中所述重组n-乙酰神经氨酸裂解酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-80℃，更优选50-80℃，更优选60-80℃下具有催化n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成所述n-乙酰神经氨酸的活性。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述第二微生物包括：大肠杆菌(escherichiacoli)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、古热球菌(thermococciarchaeon)、斯坦西摩尔氏菌(moorella stamsii)、古热浆菌(thermoplasmata archaeon)、热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)、摩尔氏菌(moorella sp.e308f)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、浮霉菌(planctomycetes bacteriumeta_a1)、嗜斜热球菌(thermococcus barophilus)、丰氏热厌氧单胞菌(thermanaeromonas toyohensis)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobiumfaecavium)和热球菌(thermococcus sp.pk)；
20.一种筛选嗜热酶的方法，其中所述方法包括：
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法进一步包括：h)将所述第二候选嗜热酶进行系统进化树分析。
22.一种表达载体，其含有可操作连接的且不按序连接的n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的编码序列和n-乙酰神经氨酸裂解酶的编码序列，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶的编码序列和所述n-乙酰神经氨酸裂解酶的编码序列在同一启动子控制之下，或分别在各自的启动子控制之下；其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-70℃，更优选50-65℃，更优选60-65℃下具有催化n-乙酰葡萄糖胺生成n-乙酰甘露糖胺的活性；和/或所述n-乙酰神经氨酸裂解酶在大于等于42℃且小于等于85℃下，优选42-80℃，更优选50-80℃，更优选60-80℃下具有催化n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成所述n-乙酰神经氨酸的活性。
23.根据权利要求22所述的表达载体，其中所述n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶为源自第一微生物的重组n-乙酰-d-葡萄糖胺2-差向异构酶，所述n-乙酰神经氨酸裂解酶为源自第二微生物的重组n-乙酰神经氨酸裂解酶；其中所述第一微生物包括厦门嗜热菌(thermophagus xiamenensis)，所述第二微生物包括：大肠杆菌(escherichia coli)、热丁酸梭菌(clostridium thermobutyricum)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、古热球菌(thermococci archaeon)、斯坦西摩尔氏菌(moorella stamsii)、古热浆菌(thermoplasmata archaeon)、热醋酸摩尔氏菌(moorella thermoacetica)、摩尔氏菌(moorella sp.e308f)、阿奎斯法拉菌(aquisphaera giovannonii)、浮霉菌(planctomycetes bacterium eta_a1)、嗜斜热球菌(thermococcus barophilus)、丰氏热厌氧单胞菌(thermanaeromonas toyohensis)、鸟粪球菌(ornithocaccomicrobiumfaecavium)和热球菌(thermococcus sp.pk)；
24.一种宿主细胞，其含有根据权利要求22或23所述的表达载体。
