本发明涉及抗体，尤其涉及一种抗肌红蛋白(mb)抗体或其抗原结合片段、包含其的药物组合物或试剂盒以及它们的应用。
背景技术：
1、肌红蛋白(mb)是一种小的血红素蛋白，是由一条肽链和一个血红素辅基组成的，分子量为17800da，在氧结合和转运中起作用。它大量存在于横纹肌组织中，在心肌和骨骼肌中存储氧气。在严重缺氧的情况下，它释放出氧气，供线粒体用于合成三磷酸腺苷(atp)。据报道，心肌的mb含量为2.5mg/g组织湿重，骨骼肌含量为4.0mg/g组织湿重(vannieuwenhoven f a,kleine ah,wodzig w h,et al.discrimination between myocardialand skeletal muscle injury by assessment of the plasma ratio of myoglobinover fatty acid-binding protein[j].circulation,1995,92:2848-2854)。mb包含血红素结合的fe(ii)阳离子，可被氧化成fe(iii)形式。mb-血红素-fe(ii)辅因子的主要功能是结合o2以及co、n2、亚硝酸盐和叠氮化物配体。也有研究表明mb的主要生物学功能可能是催化肌肉中亚硝酸盐/一氧化氮的相互转化(hendgen-cotta u b,merx m w,shiva s,etal.nitrite reductase activity of myoglobin regulates respiration and cellularviability in myocardial ischemia-reperfusion injury[j].proc natl acad sci u sa,2008,105:10256-10261；silverstein t p,kirk s r,meyer s c,etal.myoglobinstructure and function:a multiweek biochemistry laboratory project[j].biochemmol biol educ,2015,43:181-188)。近年来有报道表明mb也与细胞的抗氧化防御有关，它的过氧化物酶活性可能是脊椎动物心脏和骨骼肌在各种生理条件下的一种重要抗氧化机制，例如在骨骼肌收缩或缺氧时可能出现的机制(mannino m h,patel r s,eccardt a m,et al.myoglobin as a versatile peroxidase:implications for a more importantrole for vertebrate striated muscle in antioxidant defense[j].comp biochemphysiol b biochem mol biol,2019,234:9-17.)。
2、mb也与某些疾病密切相关，如心梗，肌萎缩，由食用小龙虾、酒精、药物毒性、烧伤、过量运动、肌肉挤压伤等引发的横纹肌溶解综合征以及其介导的急性肾损伤等(premru v,j,ponikvar r.use of myoglobin as a marker and predictor inmyoglobinuric acute kidney injury[j].ther apher dial,2013,17:391-395；lee h y,choi j s,guruprasath p,et al.an electrochemical biosensor based on amyoglobin-specific binding peptide for early diagnosis of acute myocardialinfarction[j].anal sci,2015,31:699-704)。当心肌或骨骼肌受损时，mb会因为细胞膜的破裂而被大量释放到血液中，引起一系列并发症(panizo n,rubio-navarro a,amaro-villalobos j m,et al.molecular mechanisms and novel therapeutic approaches torhabdomyolysis-induced acute kidney injury[j].kidney blood press res,2015,40:520-532)。mb是目前公认的较好的心肌损伤标志物，是急性心肌梗死(ami)早期检测的潜在靶蛋白(mihoc d,lupu l m,wiegand p,et al.antibody epitope and affinitydetermination of the myocardial infarction marker myoglobin by spr-biosensormass spectrometry[j].j am soc mass spectrom,2021,32:106-113)，在心血管疾病的急诊诊断中起着重要作用(wang q,liu f,yang x,et al.sensitive point-of-caremonitoring of cardiac biomarker myoglobin using aptamer and ubiquitouspersonal glucose meter[j].biosens bioelectron,2015,64:161-164)。在心肌梗塞后mb迅速地从坏死的心肌中释放出来，在发病1～3h即可出现异常增高，具有高度的敏感性(kimd h,seo s m,cho h m,et al.continuous immunosensing of myoglobin in humanserum as potential companion diagnostics technique[j].biosens bioelectron,2014,62:234-241；asl s k,rahimzadegan m.the recent progress in the earlydiagnosis of acute myocardial infarction based on myoglobin biomarker:nano-aptasensors approaches[j].j pharm biomed anal,2022,211:114624)。mb阴性有助于排除ami的诊断。由于mb在血中半衰期短，所以又有助于观察ami病程中有无再梗死发生以及梗死有无扩展。同时它还是ami溶栓治疗中评价再灌注与否的较敏感而准确的指标。
3、mb不仅是心肌损伤的重要标志，也是全身肌肉损伤的标志。当心肌或骨骼肌受损时，释放入血的mb到达肾脏还会进一步引发严重的肾脏损伤(pezzi m,giglio am,scozzafava a,et al.early intensive treatment to prevent kidney failure inpost-traumatic rhabdomyolysis:case report[j].sage open med case rep,2019,7:2050313x19839529)。肾小球滤过膜的基膜孔径约为60kd，只能限制血浆中大分子蛋白质滤过，mb等一些小分子蛋白质是可以通过肾滤过膜的。但mb短时间内在肾脏中的大量积聚会对肾脏产生一系列的毒性作用。如肾小球滤过液中过量mb的存在会形成mb管型，导致肾血管收缩以及严重的肾小管阻塞和坏死，从而导致急性肾损伤(das s,hanuman s b,mylapalli j l.rhabdomyolysis associated acute renal failure-report of twofatal cases and a brief review of literature[j].j forensic leg med,2020,71:101941)。mb诱导的肾脏毒性通过增加氧化应激、炎症、内皮功能障碍、血管收缩和细胞凋亡，在横纹肌溶解相关的肾脏损害中起关键作用(panizo n,rubio-navarro a,amaro-villalobos j m,et al.molecular mechanisms and novel therapeutic approaches torhabdomyolysis-induced acute kidney injury[j].kidney blood press res,2015,40:520-532；jansi prema k s,kurien a a.etiological spectrum and histopathologicaldiagnosis of rhabdomyolysis associated myoglobin cast nephropathy in southindia[j].indian j nephrol,2021,31:22-26)。当发生肾损伤时，mb还会与其他酶和电解质一起进入循环系统，导致肾阈值过度升高，从而触发肌红蛋白尿(owoicho orgah j,wangm,yang x,et al.danhong injection protects against hypertension-induced renalinjury via down-regulation of myoglobin expression in spontaneouslyhypertensive rats[j].kidney blood press res,2018,43:12-24)。因此，mb也是早期肾损伤的重要指标之一，具有很高的敏感性和特异性。同时它也是急性肾小管坏死、心肌炎、酮症酸中毒等临床疾病在早期诊断中比较敏感的指标(al-hadi h a,fox k a.cardiacmarkers in the early diagnosis and management of patients with acute coronarysyndrome[j].sultan qaboos univ med j,2009,9:231-246)。
4、此外，已有研究表明，在重症/危重新冠感染患者中，肌红蛋白和肌钙蛋白是死亡率和转化为危重疾病概率的预测因子，肌红蛋白的预测价值可能优于肌钙蛋白(zhu f,liw,lin q,et al.myoglobin and troponin as prognostic factors in patients withcovid-19pneumonia[j].med clin(engl ed),2021,157:164-171)。
5、因此，有必要制备出更多的强效抗mb中和抗体，这对临床上mb相关疾病的诊断和排查具有重要价值。本发明的目的是提供一个具有高中和活性的兔源抗mb单克隆抗体，并在此基础上提供所述高中和活性抗mb单克隆抗体在制备治疗药物和临床检测、诊断中的潜在应用。
技术实现思路
1、在一个方面，本发明提供了一种抗肌红蛋白(mb)抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vh)和/或轻链可变区(vl)，其中所述重链可变区包含来源于seq id no:1所示氨基酸序列的hcdr1、hcdr2、和hcdr3，所述轻链可变区包含来源于seq id no:2所示氨基酸序列的lcdr1、lcdr2、和lcdr3。
2、在一个具体实施方案中，所述重链可变区包含根据kabat编号系统确定的seq idno:3、4和5所示氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或所述轻链可变区包含根据kabat编号系统确定的seq id no:6、7和8所示氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
3、在一个具体实施方案中，所述重链可变区包含根据imgt编号系统确定的seq idno:9、10和11所示氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或所述轻链可变区包含根据imgt编号系统的seq id no:12、13和14所示氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
4、在一个具体实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。
5、在一个具体实施方案中，抗肌红蛋白(mb)抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区(ch)和/或轻链恒定区(cl)。
6、在一个具体实施方案中，抗肌红蛋白(mb)抗体或其抗原结合片段包含seq id no:15所示氨基酸序列的重链和/或seq id no:16所示氨基酸序列的轻链。
7、在另一个方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码上述实施方案中任一个所述的抗体或其抗原结合片段。在一个具体实施方案中，编码所述重链的核苷酸序列如seq idno:17所示，和/或编码所述轻链的核苷酸序列如seq id no:18所示。
8、在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含上述实施方案中任一个所述的多核苷酸。
9、在另一个方面，本发明提供了一种工程化细胞，其包含上述实施方案中任一个所述的多核苷酸，其中所述细胞选自原核细胞和真核细胞。在一个具体实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。
10、在另一个方面，本发明提供了一种制备上述实施方案中任一个所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在足以使上述实施方案中任一个所述的工程化细胞产生所述抗体或抗原结合片段的条件下培养所述细胞，并从所述细胞培养物中分离所述抗体或抗原结合片段。
11、在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述实施方案中任一个所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
12、在另一个方面，本发明提供了一种用于评估肌红蛋白水平的试剂盒，其包含上述实施方案中任一个所述的抗体或其抗原结合片段。在一个具体实施方案中，其用于心血管疾病的诊断或预测新型冠状病毒感染(covid-19)患者的预后。在一个具体实施方案中，其用于排除急性心肌梗死(ami)、观察ami病程中有无再梗死发生或梗死有无扩展、或用于判断ami溶栓治疗的治疗效果。
13、在另一个方面，本发明提供了一种诊断对象患有疾病或病症的方法，其包括使从所述对象获得的样品与上述实施方案中任一个所述的抗体或其抗原结合片段接触，以检测所述样品中肌红蛋白的水平。在一个具体实施方案中，其用于心血管疾病的诊断或预测新型冠状病毒感染(covid-19)患者的预后。在一个具体实施方案中，其用于排除急性心肌梗死(ami)、观察ami病程中有无再梗死发生或梗死有无扩展、或用于判断ami溶栓治疗的治疗效果。
14、在另一个方面，本发明提供了一种治疗高肌红蛋白血症的方法，其包括向有此需要的对象施用上述实施方案中任一个所述的抗体或其抗原结合片段。在一个具体实施方案中，所述高肌红蛋白血症包括心肌梗死、肌萎缩、横纹肌溶解综合征、挤压综合征、肾损伤、急性肾小管坏死和心肌炎。
15、在另一个方面，本发明提供了上述实施方案中任一个所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗高肌红蛋白血症的药物中的用途。在一个具体实施方案中，所述高肌红蛋白血症包括心肌梗死、肌萎缩、横纹肌溶解综合征、挤压综合征、肾损伤、急性肾小管坏死和心肌炎。
16、在另一个方面，本发明提供了上述实施方案中任一个所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗高肌红蛋白血症。在一个具体实施方案中，所述高肌红蛋白血症选自心肌梗死、肌萎缩、横纹肌溶解综合征、挤压综合征、肾损伤、急性肾小管坏死和心肌炎。在一个具体实施方案中，所述高肌红蛋白血症包括横纹肌溶解相关急性肾损伤(rm-aki)。
1.一种抗肌红蛋白(mb)抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vh)和/或轻链可变区(vl)，其中所述重链可变区包含来源于seq id no:1所示氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述轻链可变区包含来源于seq id no:2所示氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含根据kabat编号系统确定的seq id no:3、4和5所示氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或所述轻链可变区包含根据kabat编号系统确定的seq id no:6、7和8所示氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含根据imgt编号系统确定的seq id no:9、10和11所示氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或所述轻链可变区包含根据imgt编号系统的seq id no:12、13和14所示氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
4.权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。
5.权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含seq id no:15所示氨基酸序列的重链和/或seq id no:16所示氨基酸序列的轻链。
6.一种多核苷酸，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
7.权利要求6所述的多核苷酸，其中编码所述重链的核苷酸序列如seq id no:17所示，和/或编码所述轻链的核苷酸序列如seq id no:18所示。
8.一种载体，其包含权利要求6或7所述的多核苷酸。
9.一种工程化细胞，其包含权利要求6或7所述的多核苷酸，其中所述细胞选自原核细胞和真核细胞。
10.权利要求9所述的工程化细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
11.一种制备权利要求1-5中任一项所述抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在足以使权利要求9或10所述工程化细胞产生所述抗体或抗原结合片段的条件下培养所述细胞，并从所述细胞培养物中分离所述抗体或抗原结合片段。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
13.一种用于评估肌红蛋白水平的试剂盒，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
14.权利要求13所述的试剂盒，其用于心血管疾病的诊断或预测新型冠状病毒感染(covid-19)患者的预后，或者用于排除急性心肌梗死(ami)、观察ami病程中有无再梗死发生或梗死有无扩展、或用于判断ami溶栓治疗的治疗效果。
15.权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗高肌红蛋白血症的药物中的用途。
16.权利要求15所述的用途，其中所述高肌红蛋白血症选自心肌梗死、肌萎缩、横纹肌溶解综合征、挤压综合征、肾损伤、急性肾小管坏死和心肌炎。
