本发明涉及生物材料，具体涉及一种提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法。
背景技术：
1、泛素化修饰是细胞内普遍存在的蛋白翻译后修饰，其丰度仅次于磷酸化，在蛋白质降解和细胞信号转导中起着重要作用。泛素化修饰由76个氨基酸组成的泛素蛋白介导产生。泛素蛋白通过共价连接到靶蛋白上，形成单泛素化或多聚泛素化修饰，这一过程通过一系列酶促反应发生，包括e1激活酶、e2结合酶和e3泛素连接酶泛素蛋白。通过不同的连接方式可以形成八种不同的连接类型，分别为k6、k11、k27、k29、k33、k48、k63以及最后发现的m1泛素链。
2、由于线性泛素化(m1-linked)连接方式(一个泛素和另一个泛素以首尾相接方式连接)特殊，其靶蛋白在细胞内的复杂命运近年来也被更多学者所关注。线性泛素化在细胞内的功能包括：激活或抑制其靶蛋白活性，促进靶蛋白招募其他下游蛋白和蛋白酶体降解和干扰蛋白质与蛋白质互作，通常参与一个或者多个信号通路，例如nf-κb，nod2，trim25等通路。
3、线性化泛素链连接方式不同于其他7种lys连接方式泛素链(k6、k11、k27、k29、k33、k48、k63)且被关注的时间较短，目前商用的抗线性泛素化抗体很少。yoshiterusasaki等人使用单克隆抗体(lu b9)检测了cd40诱导的nemo线性多泛素化，该单克隆抗体特异性识别线性泛素链，具有高灵敏度。这就是后来被德国merck公司商业化的lub9|mabs451，它是一种鼠源多克隆抗体。商业化的lub9|mabs451抗体能够高效结合线性泛素链，但在实际应用过程中发现，该抗体仍保留了对其他泛素链类型如k48、k63泛素链的结合能力，因此认为该抗体不具备识别并结合线性泛素链的特异性。
4、去泛素化酶dubs介导泛素化修饰的去除和加工。dubs调节细胞多种生命过程，包括细胞周期、dna修复、细胞凋亡、炎症等信号通路。ravd是来自于嗜肺军团菌l.pneumophila中的去泛素化酶，含有324个氨基酸残基，具有特异水解线性泛素链的活性。wan等人从大肠杆菌中表达并纯化了ravd的重组蛋白，在体外和细胞实验中均证明了该蛋白对线性泛素链和线性三泛素蛋白(triub)表现出强大的去泛素酶活性。rhd1是来自嗜肺军团菌corby菌株的ravd同源蛋白，其与ravd具有83％的序列同一性，同样对线性泛素链表现高效的去泛素化酶活性，经预测rhd1(1-200aa)是其关键的去泛素化酶活性区域。对rhd1(1-200aa)与线性双泛素蛋白的复合物结构解析发现，rhd1是一种木瓜蛋白酶样去泛素酶，具有半胱氨酸-组氨酸-丝氨酸催化三联体。分别为cys13、his94和ser111。将活性氨基酸突变成为丙氨酸后发现，rhd1-c13a和rhd1-h94a突变蛋白完全丧失了去泛素化酶活性，rhd1-s111a突变蛋白的去泛素酶活性也大大减弱。前期研究表明ravd和rhd1蛋白对线性泛素链的水解具有特异性和高效性。
5、应该注意，上面对技术背景的介绍只是为了方便对本技术的技术方案进行清楚、完整的说明，并方便本领域技术人员的理解而阐述的。不能仅仅因为这些方案在本技术的背景技术部分进行了阐述而认为上述技术方案为本领域技术人员所公知。
技术实现思路
1、鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，本发明基于rhd1(1-200aa)和线性双泛素结构数据利用生物信息学软件分析其结合界面的氨基酸，选取其中的重要氨基酸位点进行点突变或组合突变，再通过elis a测定这些突变是否提高其结合线性泛素链的亲和能力，将rhd1发展成一个能够特异识别并高效结合线性泛素链的蛋白配体，为线性泛素链的功能研究提供有力工具。
2、为了达到上述目的，本发明提供了一种提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，包括以下步骤：
3、步骤1：将rhd1(1-200aa)的n端添加识别位点a和纯化标签，按照表达系统的偏好优化其密码子，构入载体a中，获得含rhd1(1-200aa)的氨基酸序列的重组质粒；所述rhd1(1-200aa)的氨基酸序列如seq id no：1所示；
4、步骤2：将tetra-ub(m1-linked)的n端添加识别位点b，构入载体b中，获得含有tetra-ub(m1-linked)序列的重组质粒；
5、步骤3：采用在含rhd1(1-200aa)的氨基酸序列的重组质粒中构建rhd1-c13a、rhd1-a92t的点突变或上述点突变的组合突变，实现rhd1(1-200aa)酶活性的失活。
6、需要说明的是，获得rhd1突变体蛋白的构建方式包括生物合成法以及化学合成法。生物合成法是指将具有rhd1基因的质粒，以某种方式(转化/转染/转座)转入生物工程菌或某种生物细胞内(大肠杆菌/哺乳动物细胞/昆虫细胞/酵母细胞)，经过表达、纯化后得到大量rhd1突变体蛋白质，可通过如下蛋白纯化方式亲和层析/离子交换层析/凝胶过滤层析/疏水层析/热稳定法/溶解度法/可逆性缔结法等，获得高纯度rhd1突变体蛋白。化学合成法是指按照氨基酸序列通过液相合成或固相合成两种方法直接获得rhd1突变体多肽。现在一般采用固相合成法，将rhd1突变体肽链末端的第一个氨基酸连接到不溶性的树脂上后反复耦合和洗脱，实现以氨基酸序列次序连接到树脂上，当连接到rhd1肽链第一个氨基酸后再将目标分子从树脂上切割下来。其中生物合成法中获得具有定点氨基酸突变的rhd1基因片段方法包括：重叠延伸pc r法和定点突变法。重叠延伸pcr法本专利中已有介绍。定点突变法是在需要突变的氨基酸位点两端设计有互补片段的正反引物再经过pcr循环后，在获得的pcr混合产物中加入dpni酶，带有rhd1野生型基因质粒有甲基化修饰而被消化，已经改造成功的双链环状质粒则不会被消化。获得具有定点氨基酸突变的rhd1质粒方法包括：核酸内切酶法和pcr扩增法。核酸内切酶法本专利中已有介绍。利用pcr技术扩增质粒的目标区域后，将所得有定点氨基酸突变的rhd1基因片段克隆到目标载体中。可使用ta克隆法或平端克隆法。
7、需要说明的是，如果rhd1(1-200aa)不丧失其作为去泛素化酶的能力，rhd1(1-200aa)就会彻底将底物tetra-ub(m1-linked)序列切开变为单泛素蛋白，而不能作为特异性结合线性泛素链的蛋白质配体。
8、步骤4：将所述含有tetra-ub(m1-linked)序列的重组质粒和进行了步骤3突变的重组质粒在所述表达系统中进行表达和鉴定，获得与tet ra-ub(m1-linked)具有较强亲和力和特异性的rhd1突变体重组蛋白。
9、需要说明的是，上述改造方法还包括：
10、步骤5：将步骤4中获得的rhd1突变体重组蛋白和其野生型重组蛋白与tetra-ub(m1-linked)进行间接elisa实验测定亲和力是否增强。
11、步骤6：将步骤5中鉴定亲和力增强的rhd1突变体重组蛋白和其野生型重组蛋白分别与tetra-ub(m1-linked)、tetra-ub(k48-linked)、tetra-ub(k63-linked)进行间接elisa实验测定是否保留其特异性识别tetra-ub(m1-linked)能力。
12、依照本发明的一个方面，所述识别位点a包括凝血酶酶切位点、factorxa切割位点、hrv3c蛋白酶切位点、tev蛋白酶切位点、肠激酶切位点、sumo蛋白酶切位点中的任意一种；所述识别位点b包括凝血酶酶切位点、factorxa切割位点、hrv3c蛋白酶切位点、tev蛋白酶切位点、肠激酶切位点、sumo蛋白酶切位点中的任意一种。
13、依照本发明的一个方面，所述载体a包括pgex-6p-2载体、pge x系列其他载体、pet系列载体、pmal系列载体、pqe系列载体中的任意一种；所述识别位点载体b包括pgex-6p-2载体、pgex系列其他载体、pet系列载体、pmal系列载体、pqe系列载体、pcmvp-neo-ban载体、pegfp表达载体、pegfp-actin表达载体、psv2表达载体、cmv4表达载体、pcdna系列表达载体、pcmv系列载体、ba culovirus表达载体、pfastbac系列表达载体、piex系列表达载体中的任意一种。
14、依照本发明的一个方面，所述表达系统包括大肠杆菌表达系统、哺乳动物表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统中的任意一种。
15、依照本发明的一个方面，所述组合突变为rhd1-c13a-a92t。
16、依照本发明的一个方面，步骤3中，所述构建的方法为重叠延伸pcr法；在重叠延伸pcr法的迭代构建过程中，rhd1(1-200aa)的正向引物序列如seq id no:3所示，反向引物序列如seq id no:4所示；点突变c13a的正向引物序列如seq id no:5所示，反向引物序列如seq id no:6所示；a92t的正向引物序列如seq id no:7所示，反向引物序列如seq id no:8所示。
17、依照本发明的一个方面，步骤4还包括：采用标签去除酶去除tet ra-ub(m1-linked)上的纯化标签，再通过离子交换柱获得没有标签蛋白的tetra-ub(m1-linked)的重组蛋白。
18、依照本发明的一个方面，所述纯化标签序列包括谷胱甘肽巯基转移酶标签、6×his标签、ha标签、flag标签、麦芽糖结合蛋白标签、nusa标签、sumo标签、strep-tag标签中的任意一种。
19、依照本发明的一个方面，所述步骤4具体为：
20、将所述含有tetra-ub(m1-linked)序列的重组质粒和进行了步骤3突变的重组质粒转入大肠杆菌bl21感受态中，涂到有氨苄抗性的lb培养基平板37℃过夜培养；
21、第二天将单菌落挑入有氨苄抗性的lb液体培养基内，37℃培养直到其od600nm值达到0.6-0.8时，向其中加入0.4mm iptg后20℃过夜培养；
22、离心获得大肠杆菌沉淀，超声破碎后取上清，利用标签序列纯化树脂纯化蛋白；
23、采用sds-page、考马斯亮蓝染色法检测并确认rhd1突变体和tetra-ub(m1-linked)纯化情况。
24、依照本发明的一个方面，所述步骤5具体为：
25、将200ng/孔的tetra-ub(m1-linked)蛋白包被到96孔elisa反应板内，4℃放置过夜；
26、每孔加入pbst 200μl(pbs含0.05％吐温20)洗涤孔板，用封闭液(pbs含10％脱脂牛奶)室温封闭2h；
27、同样用pbst洗涤后，加入pbs倍比稀释的进行了步骤4的rhd 1突变型及野生型蛋白(初始浓度100μg/ml，4倍倍比稀释)，室温孵育2h；
28、同样用pbst洗涤3遍后，每孔加入100μl，1:5000稀释的hrp-conjugated mouseanti gst-tag mab，室温孵育1h。
29、同样用pbst洗涤3遍后，避光加入100μl tmb单组份显色液，37℃孵育15min后加入等体积的2m h2so4终止反应。用酶标仪测定od450nm处的吸光值。
30、依照本发明的一个方面，所述步骤6具体为：
31、将50ng/孔的tetra-ub(m1-linked)、tetra-ub(k48-linked)、tetra-ub(k63-linked)蛋白包被到96孔elisa反应板内，4℃放置过夜；
32、每孔加入pbst 200μl(pbs含0.05％吐温20)洗涤孔板，用封闭液(pbs含10％脱脂牛奶)室温封闭2h；
33、同样用pbst洗涤后，加入pbs倍比稀释的进行了步骤4的rhd 1突变型及野生型蛋白(初始浓度400μg/ml，4倍倍比稀释)，室温孵育2h；
34、同样用pbst洗涤3遍后，每孔加入100μl，1:5000稀释的hrp-conjugated mouseanti gst-tag mab，室温孵育1h；
35、同样用pbst洗涤3遍后，避光加入100μl tmb单组份显色液，37℃孵育15min后加入等体积的2m h2so4终止反应，用酶标仪测定od450nm处的吸光值。
36、基于同一发明构思，本发明还提供了上述任一的改造方法获得的rhd1重组蛋白，所述rhd1重组蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
37、基于同一发明构思，本发明还提供了上述rhd1重组蛋白在west ern blot实验、免疫荧光实验中特异性检测组织和细胞样本中线性泛素链蛋白中的应用。
38、基于同一发明构思，本发明还提供了上述rhd1重组蛋白在实验动物、组织、细胞内实现特定活性功能进行体内过表达rhd突变体的应用。
39、本发明的有益效果：
40、本发明基于rhd1(1-200aa)和线性双泛素结构数据利用生物信息学软件分析其结合界面的氨基酸，选取其中的重要氨基酸位点进行点突变或组合突变，再通过elisa测定这些突变是否提高其结合线性泛素链的亲和能力，将rhd1发展成一个能够特异识别并高效结合线性泛素链的蛋白配体，为线性泛素链的功能研究提供有力工具。
1.一种提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，其特征在于，所述识别位点a包括凝血酶酶切位点、factorxa切割位点、hrv3c蛋白酶切位点、tev蛋白酶切位点、肠激酶切位点、sumo蛋白酶切位点中的任意一种；所述识别位点b包括凝血酶酶切位点、factorxa切割位点、hrv3c蛋白酶切位点、te v蛋白酶切位点、肠激酶切位点、sumo蛋白酶切位点中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，其特征在于，所述载体a包括pgex-6p-2载体、pgex系列其他载体、pet系列载体、pmal系列载体、pqe系列载体中的任意一种；所述识别位点载体b包括pgex-6p-2载体、pgex系列其他载体、pet系列载体、pmal系列载体、pqe系列载体、pcmv p-neo-ban载体、pegfp表达载体、pegfp-actin表达载体、psv2表达载体、cmv4表达载体、pcdna系列表达载体、pcmv系列载体、baculovirus表达载体、pfastbac系列表达载体、piex系列表达载体中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，其特征在于，所述表达系统包括大肠杆菌表达系统、哺乳动物表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，其特征在于，所述组合突变为rhd1-c13a-a92t。
6.根据权利要求1所述的提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，其特征在于，步骤3中，所述构建的方法为重叠延伸pcr法；在重叠延伸pcr法的迭代构建过程中，rhd1(1-200aa)的正向引物序列如seq id no:3所示，反向引物序列如seq id no:4所示；点突变c13a的正向引物序列如seq id no:5所示，反向引物序列如seq id no:6所示；a92t的正向引物序列如seq id no:7所示，反向引物序列如seq id no:8所示。
7.根据权利要求1所述的提高rhd1与线性泛素链亲和力并保留其特异性的改造方法，其特征在于，步骤4还包括：采用标签去除酶去除tetra-ub(m1-linked)上的纯化标签，再通过离子交换柱获得没有标签蛋白的tetra-ub(m1-linked)的重组蛋白。
8.一种由权利要求1-7任一所述的改造方法获得的rhd1重组蛋白，其特征在于，所述rhd1重组蛋白的氨基酸序列如seq id no:2。
9.一种如权利要求8所述的rhd1重组蛋白在western blot实验、免疫荧光实验中特异性检测组织和细胞样本中线性泛素链蛋白中的应用。
10.一种如权利要求8所述的rhd1重组蛋白在实验动物、组织、细胞内实现特定活性功能进行体内过表达rhd突变体的应用。
