本发明属于细胞保存的，具体涉及一种临床用犬自然杀伤细胞冷藏保存液及其制备方法和应用。
背景技术：
1、近年来，肿瘤疾病一直危害着犬的健康，是临床上导致犬死亡的常见疾病，严重影响着宠物犬的生存以及生活质量。手术疗法、放射治疗及化学疗法等传统肿瘤治疗手段虽然能在一定程度上改善犬的生存及预后，但病犬的生活质量依旧难以保证。免疫细胞过继治疗是当今肿瘤治疗的研究热点。通过过继转移自体或异体扩增的免疫细胞比如t细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等至患者体内，以恢复因癌症导致的免疫细胞数量减少，增强机体免疫力。自然杀伤细胞不需要抗原预先致敏即可杀死肿瘤细胞，且同种异体过继治疗不会引起移植物抗宿主反应，因此在肿瘤免疫治疗领域有非常好的应用前景。
2、随着犬自然杀伤细胞的表型研究逐渐明确，体外扩增体系逐渐成熟，犬自然杀伤细胞也逐渐应用于犬的肿瘤治疗。研究表明，犬自然杀伤细胞对骨肉瘤、乳腺肿瘤等有较好疗效，犬自然杀伤细胞的应用前景广阔。然而，犬自然杀伤细胞的生产与临床使用的地点往往难以统一，体外扩增得到的细胞需要运输才能到达宠物医院。多数治疗机构仅仅在细胞回输/治疗前对送达的细胞产品进行质控，容易忽视整个运输过程中的细胞质控和管理，即从细胞采集到最终治疗，在常温或37℃环境中，细胞内生化反应活跃、代谢旺盛、耗氧高、能耗大。这些生理过程会产生的大量氧自由基和脂质过氧化物，它们必须及时被清除，否则会引起环境ph和渗透压变化，造成细胞溶胀和死亡。因此，需要找到一种犬自然杀伤细胞的方便与成本低的保存方法。
3、目前，细胞的保存方式主要有冷冻保存和冷藏保存。冷冻保存即在液氮温度(-196℃)保存，通常需要血清和二甲基亚砜(dmso)，然而dmso具有细胞毒性、血管毒性和肝肾毒性，如果冻存的细胞复苏后直接使用，过多的dmso会损害犬只机体，且这种冻存方式在使用时需要超低温设备冻融而且移植前需要复苏等过程，细胞冻融和复苏过程对所有细胞和组织都有一定伤害，对于使用的宠物医院设备要求是一个挑战。冷藏保存采用低温条件(2～8℃)处理，即可降低细胞正常生理过程中产生的氧自由基和脂质过氧化物，送达的细胞无需特别处理，可直接使用，与冷冻保存相比，成本低。然而，犬自然杀伤细胞的冷藏保存需要特别的保存液，不仅要求成分安全，易于操作，而且需要保证保存后的活率与杀伤活性不会受到太大影响。因此，为保障犬自然杀伤细胞的冷藏保存和运输，研制一种高效保存犬自然杀伤细胞活性的细胞冷藏保存液尤为重要。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种临床用犬自然杀伤细胞冷藏保存液及其制备方法和应用，高效保存犬自然杀伤细胞活性，实现犬自然杀伤细胞的短期保存。
2、为了实现上述目的，本发明提供了一种细胞冷藏保存液，不添加血清和dmso，包括活性成分和溶剂；
3、所述活性成分包括右旋糖酐40、复合氨基酸、犬血清白蛋白、犬白介素2和亚硫酸氢钠；
4、所述复合氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸和缬氨酸中的三种以上；
5、所述溶剂包括生理盐水。
6、优选的，所述冷藏保存液中右旋糖酐40的浓度为45～60mg/ml；
7、所述冷藏保存液中犬血清白蛋白的浓度为10～25mg/ml；
8、所述冷藏保存液中犬白介素2的浓度为100～600iu/ml；
9、所述冷藏保存液中亚硫酸氢钠的浓度为0.38～0.5mg/ml；
10、所述冷藏保存液中复合氨基酸的浓度为9.61～27.2mg/ml。
11、优选的，所述冷藏保存液中右旋糖酐40的浓度为50mg/ml；
12、所述冷藏保存液中犬血清白蛋白的浓度为20mg/ml；
13、所述冷藏保存液中犬白介素2的浓度为400iu/ml；
14、所述冷藏保存液中亚硫酸氢钠的浓度为0.38mg/ml。
15、优选的，所述复合氨基酸由亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸和缬氨酸组成；所述复合氨基酸中亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸和缬氨酸的质量比为3.08：1.35：2.18：1.35：0.45：1.8：2.55：4.65：1.65：0.75：1.5；
16、或者，所述复合氨基酸由亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甘氨酸组成；所述复合氨基酸中亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甘氨酸的质量比为3.08：1.35：2.18：0.45：2.55；
17、或者，所述复合氨基酸由苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、盐酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸和缬氨酸组成；所述复合氨基酸中苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、盐酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸和缬氨酸的质量比为1.35：0.45：1.8：4.65：1.65：0.75：1.5。
18、本发明还提供了上述技术方案所述的冷藏保存液的制备方法，利用所述溶剂溶解所述活性成分。
19、本发明还提供了上述技术方案所述的冷藏保存液或上述技术方案所述的制备方法得到的冷藏保存液在犬自然杀伤细胞保存中的应用。
20、本发明还提供了一种临床用犬自然杀伤细胞的保存方法，包括如下步骤：
21、将犬自然杀伤细胞和上述技术方案所述的冷藏保存液或上述技术方案所述的制备方法得到的冷藏保存液混合，得到细胞悬液，4～8℃保存。
22、优选的，所述细胞悬液中犬自然杀伤细胞的密度为1×106～1×107个/ml。
23、优选的，所述细胞悬液中犬自然杀伤细胞的密度为5×106个/ml。
24、本发明还提供了上述技术方案所述的冷藏保存液或上述技术方案所述的制备方法得到的冷藏保存液在制备犬乳腺肿瘤细胞杀伤产品中的应用。
25、有益效果：
26、本发明以生理盐水为溶剂，以右旋糖酐40、复合氨基酸、犬血清白蛋白、犬白介素2和亚硫酸氢钠为活性成分；所述复合氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸和缬氨酸中的三种以上。本发明提供的冷藏保存液不含血清和dmso，成分构成稳定、安全，得到的细胞冷藏保存液中各成分协同作用，为犬自然杀伤细胞提供了稳定的生存环境、基础代谢所需的能量以及机械保护，能稳定地维持细胞代谢稳态，实现犬自然杀伤细胞的体外保存，增加犬自然杀伤细胞的保存时间。实施例结果表明，在4℃～8℃的条件下保存72h，犬自然杀伤细胞的活率可保持在80％以上，并保留着较好的增殖活性，可直接输注至犬体内，保留着较好的犬乳腺肿瘤细胞的杀伤活性，为犬自然杀伤细胞的短途运输以及临床应用提供了便利。
1.一种细胞冷藏保存液，其特征在于，不添加血清和dmso，包括活性成分和溶剂；
2.根据权利要求1所述的冷藏保存液，其特征在于，所述冷藏保存液中右旋糖酐40的浓度为45～60mg/ml；
3.根据权利要求2所述的冷藏保存液，其特征在于，所述冷藏保存液中右旋糖酐40的浓度为50mg/ml；
4.根据权利要求1～3任一项所述的冷藏保存液，其特征在于，所述复合氨基酸由亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸和缬氨酸组成；所述复合氨基酸中亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、盐酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸和缬氨酸的质量比为3.08：1.35：2.18：1.35：0.45：1.8：2.55：4.65：1.65：0.75：1.5；
5.权利要求1～4任一项所述的冷藏保存液的制备方法，其特征在于，利用所述溶剂溶解所述活性成分。
6.权利要求1～4任一项所述的冷藏保存液或权利要求5所述的制备方法得到的冷藏保存液在犬自然杀伤细胞保存中的应用。
7.一种临床用犬自然杀伤细胞的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的保存方法，其特征在于，所述细胞悬液中犬自然杀伤细胞的密度为1×106～1×107个/ml。
9.根据权利要求8所述的保存方法，其特征在于，所述细胞悬液中犬自然杀伤细胞的密度为5×106个/ml。
10.权利要求1～4任一项所述的冷藏保存液或权利要求5所述的制备方法得到的冷藏保存液在制备犬乳腺肿瘤细胞杀伤产品中的应用。
