本发明涉及生物，尤其涉及一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶及其制备方法。
背景技术：
1、骨关节炎（osteoarthritis，oa）是最常见的具有高复发性、高致残率的关节疾病之一，给患者和社会造成了沉重的负担，软骨缺损是骨关节炎的最常见症状之一。据调查显示，骨关节炎患病率随着人口老龄化程度的增加有逐渐上升的趋势，将成为世界人口残疾的最主要原因。
2、目前对软骨损伤和骨关节炎的药物治疗目标仍然停留在止痛和缓解症状。软骨损伤及关节炎的药物治疗主要包括：1)注射透明质酸钠润滑液；2)口服氨基葡萄糖和硫酸软骨素等；3)使用非类固醇抗炎药等方法。另外，局部给药和全身给药是目前用于骨关节治疗的2种给药途径。与全身给药相比，oa患者通过关节腔内注射可以获得更高的局部药物浓度，从而减少不良反应。然而，局部注射透明质酸钠不能起到促进软骨细胞再生和内在修复，无法促进形成纤维软骨，其作用主要是关节腔润滑。氨基葡萄糖等口服后进入人体消化系统，降解成葡萄糖、氨基酸等，不能以原有的形式到达关节发挥作用。胶原蛋白是动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨等结缔组织的主要成分。
3、研究发现，软骨基质中胶原纤维网的破坏和蛋白多糖的丢失，进而导致软骨细胞的变性和坏死，由浅及深，最终出现软骨全层消失及软骨下骨增生。软骨中胶原的持续降解导致软骨破坏及关节退变，在软骨损伤早期在关节腔内注射ii型胶原，为软骨组织补充外源性ii型胶原将有利于缓解损伤进程，促进软骨自我修复，从而达到根治损伤和避免关节退变引起关节炎。
4、然而，目前ii型胶原的获得方式主要是通过动物组织提取，且仅限于小规模实验室研究。真正能够实施生产，质量要求达到无毒、无热源、无菌、高活性和高纯度的原料几乎没有。随着基因工程技术的迅猛发展，利用合成生物学技术获得重组ii型人源化胶原蛋白具有广阔的应用前景。
5、与从动物中提取的天然胶原蛋白相比，重组ii型人源化胶原蛋白具有低抗原性，彻底杜绝了动物源材料所不可避免的病毒隐患，保证了凝胶材料在临床使用中的安全性。应用ii型胶原进行关节腔注射用于软骨缺损、关节炎治疗国内已经有文献报道，但未见有重组ii型人源化胶原蛋白与其他多糖类辅料配比制备的无免疫原性、无毒、无热原、高活性的微交联关节软骨修复凝胶的研究报道。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶及其制备方法。
2、为解决上述问题，本发明所采取的技术方案是：
3、一方面，提供了一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶，其由重组ii型人源化胶原蛋白、透明质酸钠和硫酸软骨素通过edc/nhs化学交联后得到；
4、其中，按质量份数计，原料包括：重组ii型人源化胶原蛋白8-20份、透明质酸钠0.5~2份、硫酸软骨素0.3~1份。
5、另一方面，提供了一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶的制备方法，方法包括：
6、步骤s1、利用生物基因工程技术制备重组ii型人源化胶原蛋白；
7、步骤s2、将重组ii型人源化胶原蛋白、透明质酸钠和硫酸软骨素混合后配制成混合溶液，向所述混合溶液中加入交联剂溶液后得到微交联的可注射凝胶；
8、步骤s3、对所述可注射凝胶进行透析以除去交联剂得到透析完成的凝胶；
9、步骤s4、将透析完成的凝胶进行高温高压湿热灭菌后，无菌灌装至预灌装注射器中，即得微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶。
10、作为发明的一种实施方式，所述重组ii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列如seq idno.1所示。
11、作为发明的一种实施方式，所述重组人ii型胶原蛋白的核苷酸序列如seq idno.2所示。
12、作为发明的一种实施方式，步骤s1中，重组ii型人源化胶原蛋白的制备方法具体包括如下步骤：
13、（1）蛋白序列设计
14、根据人ii型胶原蛋白，设计如seq no.1所示的氨基酸序列；
15、（2）基因设计和合成
16、根据步骤（1）中所述的重组人ii型胶原蛋白的氨基酸序列反向设计编码核酸序列，并进行密码子优化，得到编码重组人ii型胶原蛋白的核苷酸序列，然后进行基因合成，得到编码所述重组人ii型胶原蛋白片段的核酸片段；
17、（3）表达载体的构建：
18、通过ndei和xhoi多克隆位点连接到pet30a(+)质粒上，得到表达质粒；
19、（4）表达菌株的构建和筛选：
20、将步骤（3）中所述质粒通过热激法转入宿主细胞感受态中，涂布在含有卡那霉素的抗性板上，培养，获得表达菌株；
21、（5）诱导表达
22、对步骤（4）得到的表达菌株进行诱导表达，收集菌液；
23、（6）纯化
24、对步骤（5）收集的菌液进行菌体破碎和离心、亲和层析、离子交换层析、脱盐、冻干后得到重组人ii型胶原蛋白冻干品。
25、作为发明的一种实施方式，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
26、作为发明的一种实施方式，步骤s2包括：
27、步骤s201、将重组ii型人源化胶原蛋白、透明质酸钠、硫酸软骨素加入冷却至30℃以下的0.01m pbs溶液中配制成混合溶液；其中，混合溶液中，所述重组ii型人源化胶原蛋白的浓度为80~200mg/ml，透明质酸钠的浓度为5~20mg/ml，所述硫酸软骨素的浓度为3~10mg/ml；
28、步骤s202、边搅拌混合溶液边滴加edc/nhs交联剂溶液，滴加完成后继续搅拌反应3~5min，之后将反应液置于4℃交联48h，得到微交联的可注射凝胶；其中，以edc记，edc/nhs浓度为0.2%，edc与nhs的质量比为1:1~1:4。
29、作为发明的一种实施方式，步骤s3包括：将所述可注射凝胶用0.1m pbs进行4~8℃低温透析，每2h更换1次新的透析液，透析5次以除去交联剂。
30、作为发明的一种实施方式，步骤s4包括：
31、步骤s401、将透析完成的凝胶采用高温高压湿热灭菌，灭菌条件为121℃ 20分钟，灭菌后凝胶状态为可通过注射针头挤出；
32、步骤s402、将凝胶无菌灌装至预灌装注射器中，即得微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶。
33、采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
34、本发明所提供的微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶，其中的重组ii型人源化胶原蛋白具有天然胶原蛋白的优良性质，并且无任何病毒隐患和免疫原性；透明质酸钠是关节腔滑液的主要成分，也是软骨基质的成分之一，在关节中起润滑作用，减少组织间的摩擦；硫酸软骨素具有止痛，促进软骨再生的功效。将这三种材料采用化学交联的方式制备成微交联的修复凝胶，具备生物相容性和可降解性。与单纯透明质酸相比，微交联后粘度增加，有效润滑关节，在软骨缺损部位保留时间长，维持一定的降解率，并且促进内源性胶原蛋白和透明质酸的合成分泌，注射频次大大降低；另外，将该凝胶应用于家兔软骨缺损模型，表明该微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶对软骨缺损起到良好的修复作用，在生物材料领域拥有极大的潜力和应用价值。
35、本发明所提供的凝胶的制备过程中没有任何有毒物质的残留，所用的原料均无生物学毒性，因此所制备的凝胶具有良好的生物相容性，同时该种凝胶还具备良好的生物降解特性，具有诱导成骨的作用，可促进骨缺损的修复。
36、本发明提供的重组ii型人源化胶原蛋白制备方法，其原料没有动物来源的感染源，生物安全性高，能广泛应用于医药、医疗器械、生物材料、组织工程、化妆品等领域；选用的序列具有rgd和gapger整合素结合位点，能够促进细胞与该重组人ii型胶原蛋白的粘附。
1.一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶，其特征在于，其由重组ii型人源化胶原蛋白、透明质酸钠和硫酸软骨素通过edc/nhs化学交联后得到；
2.一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶的制备方法，其特征在于，方法包括：
3.根据权利要求2所述的一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶的制备方法，其特征在于，所述重组ii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求3所述的一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶的制备方法，其特征在于，所述重组人ii型胶原蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求3所述的一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s1中，重组ii型人源化胶原蛋白的制备方法具体包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
7.根据权利要求2所述的一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s2包括：
8.根据权利要求2所述的一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶，其特征在于，步骤s3包括：将所述可注射凝胶用0.1m pbs进行4~8℃低温透析，每2h更换1次新的透析液，透析5次以除去交联剂。
9.根据权利要求2所述的一种微交联重组胶原蛋白关节软骨修复凝胶，其特征在于，步骤s4包括：
