本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种毕赤酵母高效无痕基因敲除载体及其应用。
背景技术：
1、毕赤酵母(pichia pastoris)在现代工业中应用非常广泛，其属于甲基营养型微生物，能以甲醇为唯一碳源进行生长。毕赤酵母因其生长较快、基因操作相对简单、拥有诸多可选的强启动子、蛋白表达效率较高、能执行翻译后修饰、分泌的杂蛋白少、易于实现高密度发酵等优点，已被广泛用于表达各种异源蛋白。该酵母含有目前调控机理最为严谨的醇氧化酶强启动子paox1，其可在甲醇为唯一碳源的时候严格调控下游基因的表达，是毕赤酵母表达系统最常用的启动子之一。近年来，有学者在进行毕赤酵母鼠李糖代谢途径相关基因及其调控基因rhar的研究时发现，lra3基因的启动子plra3是一种诱导型启动子，其可在鼠李糖诱导下实现重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达。诸多可用的基因元件极大地促进了毕赤酵母表达系统在食品酶和医药重组蛋白领域的应用。
2、众所周知，研究中经常需要对某个或某些基因进行敲除以改造菌株，从而实现一些特定的生物学目的。长期以来，基因敲除常通过同源重组双交换实现。而酵母体内存在同源重组(homologous recombination，hr)和非同源末端连接(non-homologous endjoining，nhej)两种机制共同参与断链dna修复。在一些传统酵母如酿酒酵母中，其主要依赖同源重组修复机制，仅需约50bp的同源片段即可有效实现基因敲除。然而，毕赤酵母作为一种非典型酵母，其体内的非同源末端连接机制占主导地位，往往需使用超过1kb的同源臂才能实现一定的基因敲除率，即使如此，采用同源重组双交换法进行基因敲除的效率仍然较低。
3、除了使用更长的同源臂之外，也有一些策略被开发用于提高毕赤酵母中双交换法基因敲除的效率。比如，通过敲除或破坏ku70基因等方式降低或抑制nhej途径的效率，或将酿酒酵母参与同源重组机制的关键基因scrad52引入毕赤酵母增加同源重组机制的效率，以此提高同源双交换的效率。尽管可行，但宿主体内dna修复机制效率的改变导致的高效率同源重组可能会导致基因组的不稳定或其他难以预知的风险。另外，借助游离性辅助载体将待敲除基因表达盒转入毕赤酵母体内，通过增加冗余目的基因的方式，通过缓解目的基因敲除后可能存在的生长状态受损等情况以提高基因敲除的效率，但其敲除基因后还需进一步去除辅助载体，显得相对麻烦。
4、除敲除效率以外，使用传统的双交换法实现基因敲除后通常还会在毕赤酵母基因组留下筛选标记基因，这又不利于在单个宿主体内进行多轮基因操作。尽管采用cre/loxp、flp/frt位点特异性重组或mazf、ura3反筛选标记基因等工具可实现基因敲除后筛选标记的回收，但当前基于这些工具进行毕赤酵母无标记基因敲除仍主要依赖双交换，难以兼顾敲除效率。
5、除双交换法之外，pop-in/pop-out法利用载体单交换整合后实施反筛选，可实现基因的无痕敲除，但该方法中反筛选标记也可通过恢复为野生型宿主的分子内重组方式而剔除，这导致该方法进行基因敲除的效率也不太高。近年来，随着生物学的发展，基于crispr-cas9的基因编辑工具也逐步应用于毕赤酵母基因敲除，通过grna引导cas9核酸酶对靶向dna位点进行切割产生双链断裂，利用酵母同源重组机制或非同源末端连接机制修复断裂缺口，造成完全切除或移码突变来实现目的基因的敲除。crispr-cas系统操作简单，也可高效地实现无标记基因编辑。但在实际操作中，基因编辑的效率也常因选择的sgrna和目的基因而异，在未破坏nhej途径时无痕敲除全长基因的效率仍不够高，实现基因敲除后也需去除cas9表达载体，且其还存在基因脱靶的风险。
6、尽管已有多种方法实现毕赤酵母中基因敲除，但现有方法实现基因敲除的效率仍不够高，或敲除后会残留筛选标记基因，一些方法需在抑制nehj途径的条件下才能有效实现无痕敲除，而在不改变宿主dna修复机制的前提下仍难以实现高效的无痕敲除。
7、因此，开发一种不需抑制nehj途径仍能实现毕赤酵母的高效无痕基因敲除方法具有重要的意义。
技术实现思路
1、针对现有技术中毕赤酵母基因敲除的效率低、使用的同源臂较长、基因敲除效率与筛选标记剔除效率难以兼顾、点突变敲除需大量测序或需依赖抑制nhej途径等技术缺陷或改进需求，本发明提供了一种应用于毕赤酵母高效无痕基因敲除载体及其应用。
2、为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种毕赤酵母无痕基因敲除载体，该载体包括目的片段5′端上游同源序列、目的片段3′端下游同源序列、目的片段内部同源序列、由a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒、由b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒、毕赤酵母正向筛选标记、大肠杆菌筛选标记和复制起点；
3、所述目的片段为待敲除的片段；
4、所述a条件和b条件为两种不同的诱导条件；
5、所述敲除载体上，目的片段5′端上游同源序列、目的片段3′端下游同源序列和目的片段内部同源序列的方向与这三个序列在毕赤酵母基因组上原有的方向一致，且所述目的片段5′端上游同源序列与目的片段3′端下游同源序列的5′端直接连接形成紧邻片段；
6、所述敲除载体上，由a条件和b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒这两个片段不直接相连，这两个表达盒的两端在载体上分别被所述紧邻片段和所述目的片段内部同源序列隔开；
7、所述敲除载体上，当毕赤酵母正向筛选标记位于目的片段5′端上游同源序列的5′端和目的片段内部同源序列的3′端之间时，以目的片段3′端下游同源序列或目的片段同源序列作为该敲除载体单交换整合毕赤酵母时的同源臂；当毕赤酵母正向筛选标记位于目的片段3′端下游同源序列的3′端和目的片段内部同源序列的5′端之间时，以目的片段5′端上游同源序列或目的片段同源序列作为该敲除载体单交换整合毕赤酵母时的同源臂。
8、优选地，所述敲除载体整合入毕赤酵母目的同源位点后，所述由a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒用于在使用a条件诱导时产生对宿主的压力，进而诱导宿主发生分子内重组去除该压力基因表达盒而解除该压力；所述敲除载体整合入毕赤酵母目的同源位点后，所述由b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒用于在使用b条件诱导时产生对宿主的压力，进而诱导宿主发生分子内重组去除该压力基因表达盒而解除该压力。
9、优选地，当使用所述a条件时，由所述b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒不对宿主产生促进该压力基因表达盒丢失的压力；当使用所述b条件时，由所述a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒不对宿主产生促进该压力基因表达盒丢失的压力。
10、优选地，所述敲除载体上，毕赤酵母正向筛选标记的任意一端序列中，由a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒的任意一端的序列与该表达盒内部及其另一端序列之间不存在方向相同的重复dna元件，且由b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒的任意一端的序列与该表达盒内部及其另一端序列之间也不存在方向相同的重复dna元件。
11、优选地，所述毕赤酵母正向筛选标记为抗生素筛选标记或营养缺陷型筛选标记；所述毕赤酵母压力基因表达盒为反筛选基因标记表达盒。
12、优选地，由两种不同条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒分别为由甲醇诱导型paox1启动子和鼠李糖诱导型plra3启动子调控的mazf反筛选基因表达盒。
13、优选地，当所述目的片段5′端上游同源序列、目的片段3′端下游同源序列或目的片段内部同源序列被选为同源臂时，该被选为同源臂的片段的长度不小于500bp，且该选为同源臂的片段内部含有所述敲除载体上唯一存在的酶切位点。
14、根据本发明另一方面，提供了任一所述毕赤酵母无痕基因敲除载体在实现无痕敲除毕赤酵母目的片段方面的应用。
15、优选地，包括以下步骤：
16、(1)在所述敲除载体被选为同源臂的内部通过酶切或pcr进行线性化后转化毕赤酵母，使用筛选培养基筛选得到该载体以同源臂单交换整合入宿主的第一轮重组子；所述筛选培养基为所述毕赤酵母正向筛选标记对应的筛选培养基；
17、(2)当所述敲除载体上，毕赤酵母正向筛选标记与由a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒均介于所述紧邻片段和目的片段内部同源序列的同一端之间时，将第一轮重组子接种至第一轮诱导培养基进行诱导，分离单克隆后得到第二轮重组子；再将第二轮重组子接种至第二轮诱导培养基进行诱导，分离单克隆后，通过基因组验证确认，即筛选得到目的片段被无痕敲除的转化子；所述第一轮诱导培养基为使用诱导条件b且能筛选所述毕赤酵母正向筛选标记对应的培养基；所述第二轮诱导培养基为使用诱导条件a且不含筛选所述毕赤酵母正向筛选标记对应的培养基；
18、当所述敲除载体上，毕赤酵母正向筛选标记与由b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒均介于所述紧邻片段和目的片段内部同源序列的同一端之间时，将第一轮重组子接种至第一轮诱导培养基进行诱导，分离单克隆后得到第二轮重组子；再将第二轮重组子接种至第二轮诱导培养基进行诱导，分离单克隆后，通过基因组验证确认，即筛选得到目的片段被无痕敲除的转化子；所述第一轮诱导培养基为使用诱导条件a且能筛选所述毕赤酵母正向筛选标记对应的培养基；所述第二轮诱导培养基为使用诱导条件b且不含筛选所述毕赤酵母正向筛选标记对应的培养基。
19、优选地，步骤(1)中，转化毕赤酵母采用电转化法。
20、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
21、(1)本发明不需要抑制宿主体内非同源末端连接途径效率，即可显著地提高毕赤酵母基因敲除成功率。本发明改进了基于反筛选标记的pop-in/pop-out法进行基因敲除，通过将构建的基因敲除载体线性化后电转化入毕赤酵母感受态细胞，一方面由于毕赤酵母中同源重组单交换效率极高，另一方面通过选择合适的同源位点可使得载体单交换插入目的位点后对目的基因的功能影响较小，使得载体能以极高的效率单交换整合入目的基因位点，有效地避免了同源重组双交换过程中因非同源末端连接机制和直接破坏目的基因给细胞造成压力等因素导致的效率降低。随后，通过一轮正负筛选后施加一轮反筛选引导两个压力基因表达盒分别发生指定的分子内重组方式而丢失，最终可有效实现目的dna片段的剔除，且阳性率极高，并极大了减少了筛选的工作量。
22、(2)本发明可有效实现dna片段的无痕敲除，为毕赤酵母的改造提供了极大的便利。通过特殊的设计，将两个压力基因表达盒进行合理分布，使得敲除载体高效单交换插入目的位点后，通过一轮正负筛选引导其中一个压力基因表达盒以指定的同源片段处发生分子内重组而丢失，同时将载体单交换引入的冗余同源臂剔除，使得第二种压力基因表达盒两端仅存在一对方向相同的重复dna片段。在此基础上，通过第二轮反筛选引导另外一个压力基因表达盒发生分子内重组而剔除。在两轮分子内重组过程中，目的基因片段、毕赤酵母正向筛选标记、大肠杆菌抗生素基因及所有待剔除的dna序列均被剔除，最终高效地实现无痕敲除。
1.一种毕赤酵母无痕基因敲除载体，其特征在于，该载体包括目的片段5′端上游同源序列、目的片段3′端下游同源序列、目的片段内部同源序列、由a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒、由b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒、毕赤酵母正向筛选标记、大肠杆菌筛选标记和复制起点；
2.如权利要求1所述的毕赤酵母无痕基因敲除载体，其特征在于，所述敲除载体整合入毕赤酵母目的同源位点后，所述由a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒用于在使用a条件诱导时产生对宿主的压力，进而诱导宿主发生分子内重组去除该压力基因表达盒而解除该压力；所述敲除载体整合入毕赤酵母目的同源位点后，所述由b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒用于在使用b条件诱导时产生对宿主的压力，进而诱导宿主发生分子内重组去除该压力基因表达盒而解除该压力。
3.如权利要求1所述的毕赤酵母无痕基因敲除载体，其特征在于，当使用所述a条件时，由所述b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒不对宿主产生促进该压力基因表达盒丢失的压力；当使用所述b条件时，由所述a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒不对宿主产生促进该压力基因表达盒丢失的压力。
4.如权利要求1所述的毕赤酵母无痕基因敲除载体，其特征在于，所述敲除载体上，毕赤酵母正向筛选标记的任意一端序列中，由a条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒的任意一端的序列与该表达盒内部及其另一端序列之间不存在方向相同的重复dna元件，且由b条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒的任意一端的序列与该表达盒内部及其另一端序列之间也不存在方向相同的重复dna元件。
5.如权利要求4所述的毕赤酵母无痕基因敲除载体，其特征在于，所述毕赤酵母正向筛选标记为抗生素筛选标记或营养缺陷型筛选标记；所述毕赤酵母压力基因表达盒为反筛选基因标记表达盒。
6.如权利要求1所述的毕赤酵母无痕基因敲除载体，其特征在于，由两种不同条件诱导的毕赤酵母压力基因表达盒分别为由甲醇诱导型paox1启动子和鼠李糖诱导型plra3启动子调控的mazf反筛选基因表达盒。
7.如权利要求1所述的毕赤酵母无痕基因敲除载体，其特征在于，当所述目的片段5′端上游同源序列、目的片段3′端下游同源序列或目的片段内部同源序列被选为同源臂时，该被选为同源臂的片段的长度不小于500bp，且该选为同源臂的片段内部含有所述敲除载体上唯一存在的酶切位点。
8.如权利要求1-7任一所述毕赤酵母无痕基因敲除载体在实现无痕敲除毕赤酵母目的片段方面的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，转化毕赤酵母采用电转化法。
