本发明属于微生物，更具体地说，涉及一株葡萄牙棒孢酵母m16-28及其诱变方法和应用。
背景技术：
1、硒(se)是人体必需的微量元素，对人体生命活动非常重要，参与合成人体内多种含硒酶和含硒蛋白，具有抗氧化、抗衰老、抗癌症等多种生物功能。对大多数人而言，适量补充硒元素，对维持身体健康、预防某些疾病发生具有积极的意义。富硒酵母作为一种有机硒源，生物活性和安全性更高，是富硒功能性产品的理想添加剂。
2、酵母菌是一类具有产酯能力的微生物，所产生的酯类物质在塑造酒的香气和风味特征方面起着至关重要的作用，赋予果香、花香等。这些酯类在酒中的存在和平衡可以大大增强其芳香复杂性。用于产酯的非酿酒酵母有克鲁维毕赤酵母、hanseniasporathailandica、葡萄牙棒孢酵母等。所产生的酯类物质中己酸乙酯是其中的特色风味物质，但其在天然的产酯酵母中研究较少，且产量低。
3、常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma，artp)产生等离子体射流，改变细胞壁和质膜的结构和通透性，导致dna损伤，导致突变率增加，对人体或环境无害，并在常温下常压下进行，且操作简单、突变率高。
4、将常压室温等离子体(artp)诱变技术应用于枸杞内生酵母——葡萄牙棒孢酵母选育，有利于富硒产品的开发和挖掘。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于一株葡萄牙棒孢酵母m16-28。本发明所要解决的另一技术问题在于提供葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法。本发明还要解决的技术问题在于提供葡萄牙棒孢酵母m16-28的应用，用于食品发酵。
2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
3、一株葡萄牙棒孢酵母m16-28，分类命名为葡萄牙棒孢酵母clavisporalusitaniae，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.30300，保藏日期：2024年4月10日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
4、葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法，步骤为：
5、1)将枸杞内生酵母m16活化后接种到含有硒的培养基上进行培养筛选，筛选出富硒能力较强的非酿酒酵母-葡萄牙棒孢酵母m16；
6、2)将葡萄牙棒孢酵母m16进行artp诱变，使致死率达到91.26％；
7、3)对诱变后的葡萄牙棒孢酵母m16进行初步筛选获得起酵能力快、发酵能力强、乙醇耐受性高、高盐耐受性、高糖耐受性和低ph耐受性的菌株；
8、4)将初步筛选获得的葡萄牙棒孢酵母m16的产香能力进行复筛，最终获得产香能力提升的诱变葡萄牙棒孢酵母m16-28。
9、所述artp诱变的试验参数为：诱变仪紫外杀菌30min，气体为99.999％高纯度氦气，诱变功率120w，温度20℃，载片距发射源2mm，诱变时间间隔为10s。
10、步骤1)具体为：将枸杞内生酵母m16从-20℃取出，在ypd固体培养基上进行平板划线培养，在28℃下活化培养48h；将活化好的菌株，挑取单菌落接种到含有浓度为20μg/ml硒的ypd固体培养基上培养48h，根据酵母菌的长势，选出长势较好的酵母菌分别按5％的接种量接种于含有硒质量浓度为0、5、10、20、30、40、50μg/ml的ypd液体培养基的试管中28℃培养48h，进行液体培养筛选，通过耐硒法和红硒法筛选出富硒能力较强的非酿酒酵母-葡萄牙棒孢酵母m16。
11、步骤2)具体为：将葡萄牙棒孢酵母m16在28℃进行摇瓶培养，取对数时期16h的原始菌液，将菌液浓度稀释至0.787倍；吸取10μl菌液于载片上，置于诱变室凹槽中，设置artp诱变的试验参数后开始artp诱变试验；将处理好的载片分别装在含有1ml 0.9％无菌生理盐水的ep管中，并用涡旋振荡器振荡1min进行洗脱，后将菌液稀释10-1-10-4倍；分别吸取100μl涂布在ypd固体培养基中，28℃培养48h，在50s时，记录10-4的菌落数，计算致死率，使致死率达到91.26％后进行下一步筛选工作。
12、步骤3)具体为：将诱变后的葡萄牙棒孢酵母m16进行ttc培养基、杜氏小管发酵法、乙醇耐受性、氯化钠盐溶液耐受性、葡萄糖质量浓度耐受性、ph耐受性筛选获得起酵能力快、发酵能力强、乙醇耐受性高、高盐耐受性、高糖耐受性和低ph耐受性的菌株。
13、步骤4)具体为：将初步筛选获得的葡萄牙棒孢酵母m16的产香能力、产酸和产酯能力进行复筛，最终获得产香能力提升、总酯和总酸含量均显著高于原始菌株m16的葡萄牙棒孢酵母m16-28。
14、葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法诱变得到的葡萄牙棒孢酵母m16-28。
15、葡萄牙棒孢酵母m16-28在枸杞苦荞糯米黄酒发酵中的应用。
16、葡萄牙棒孢酵母m16-28在枸杞原浆发酵中的应用。
17、相比于现有技术，本发明的有益效果为：
18、1)本发明将枸杞内生酵母m16活化后接种到含有硒的培养基上进行培养筛选，筛选出富硒能力较强的非酿酒酵母-葡萄牙棒孢酵母m16；将葡萄牙棒孢酵母m16进行artp诱变，使致死率达到91.26％；对诱变后的葡萄牙棒孢酵母m16进行初步筛选获得起酵能力快、发酵能力强、乙醇耐受性高、高盐耐受性、高糖耐受性和低ph耐受性的菌株；将初步筛选获得的葡萄牙棒孢酵母m16的产香能力(产酸和产酯能力)进行复筛，最终获得产香能力提升，即总酯和总酸含量均显著高于原始菌株m16的葡萄牙棒孢酵母m16-28。
19、2)使用m16和m16-28菌株制得的枸杞苦荞黄酒中，总酯(乙酸乙酯)含量分别为4.06、5.16；与m16菌株相比，m16-28菌株制得的枸杞苦荞黄酒中总酯含量提升了27.09％。
20、3)使用m16和m16-28菌株制得的枸杞苦荞黄酒中，总酸(乳酸)含量分别为6.75，6.975；与m16菌株相比，m16-28菌株制得的枸杞苦荞黄酒中总酸(乳酸)含量提升了3.33％。
21、4)在枸杞原浆中分别按5％接种酵母m16和诱变菌株m16-28，所得富硒枸杞原浆中m16和m16-28的硒含量分别为0.012mg/l和0.036mg/l，相较于原始菌株接种于枸杞原浆中，诱变后的菌株接种于枸杞原浆的硒含量是原始的3倍。
1.一株葡萄牙棒孢酵母m16-28，分类命名为葡萄牙棒孢酵母clavispora lusitaniae，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.30300，保藏日期：2024年4月10日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法，其特征在于，步骤为：
3.根据权利要求2所述的葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法，其特征在于，所述artp诱变的试验参数为：诱变仪紫外杀菌30min，气体为99.999％高纯度氦气，诱变功率120w，温度20℃，载片距发射源2mm，诱变时间间隔为10s。
4.根据权利要求2所述的葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法，其特征在于，步骤1)具体为：将枸杞内生酵母m16从-20℃取出，在ypd固体培养基上进行平板划线培养，在28℃下活化培养48h；将活化好的菌株，挑取单菌落接种到含有浓度为20μg/ml硒的ypd固体培养基上培养48h，根据酵母菌的长势，选出长势较好的酵母菌分别按5％的接种量接种于含有硒质量浓度为0、5、10、20、30、40、50μg/ml的ypd液体培养基的试管中28℃培养48h，进行液体培养筛选，通过耐硒法和红硒法筛选出富硒能力较强的非酿酒酵母-葡萄牙棒孢酵母m16。
5.根据权利要求2所述的葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法，其特征在于，步骤2)具体为：将葡萄牙棒孢酵母m16在28℃进行摇瓶培养，取对数时期16h的原始菌液，将菌液浓度稀释至0.787倍；吸取10μl菌液于载片上，置于诱变室凹槽中，设置artp诱变的试验参数后开始artp诱变试验；将处理好的载片分别装在含有1ml 0.9％无菌生理盐水的ep管中，并用涡旋振荡器振荡1min进行洗脱，后将菌液稀释10-1-10-4倍；分别吸取100μl涂布在ypd固体培养基中，28℃培养48h，在50s时，记录10-4的菌落数，计算致死率，使致死率达到91.26％后进行下一步筛选工作。
6.根据权利要求2所述的葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法，其特征在于，步骤3)具体为：将诱变后的葡萄牙棒孢酵母m16进行ttc培养基、杜氏小管发酵法、乙醇耐受性、氯化钠盐溶液耐受性、葡萄糖质量浓度耐受性、ph耐受性筛选获得起酵能力快、发酵能力强、乙醇耐受性高、高盐耐受性、高糖耐受性和低ph耐受性的菌株。
7.根据权利要求2所述的葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法，其特征在于，步骤4)具体为：将初步筛选获得的葡萄牙棒孢酵母m16的产香能力、产酸和产酯能力进行复筛，最终获得产香能力提升、总酯和总酸含量均显著高于原始菌株m16的葡萄牙棒孢酵母m16-28。
8.权利要求2-7任一所述的葡萄牙棒孢酵母m16-28的诱变方法诱变得到的葡萄牙棒孢酵母m16-28。
9.权利要求8所述的葡萄牙棒孢酵母m16-28在枸杞苦荞糯米黄酒发酵中的应用。
10.权利要求8所述的葡萄牙棒孢酵母m16-28在枸杞原浆发酵中的应用。
