本技术涉及微生物发酵生产的，更具体地说，它涉及一种双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法。
背景技术：
1、酮基-d-葡萄糖酸，又被称为2-酮-d-葡萄糖酸，是一种葡萄糖酸的衍生物，其在食品、医药、毛纺、电镀、饲料加工、工业水处理及石油化工领域均有广泛应用，同时，还可以直接作为食品添加剂使用。另外，2-酮基-d-葡萄糖酸还可以通过进一步的化学反应生成其他具有高附加值的化合物，如2-丁二醇、丁二酸等，因此，酮基-d-葡萄糖酸的生产和应用对于促进经济发展和改善人民生活具有重要意义。
2、国内外普遍采用生物发酵和化学合成相结合的工艺制备2-酮基-d-葡萄糖酸，其主要过程是将淀粉用酶水解生成葡萄糖，然后用细菌以葡萄糖为底物发酵生产2-酮基-d-葡萄糖，然后再进行化学合成得到2-酮基-d-葡萄糖酸。
3、在工业化生产中，通常采用葡萄糖和玉米浆分别作为2-酮基-d-葡萄糖酸发酵的碳源和氮源，但是上述工艺生产存在着高浓度发酵周期长、菌种不耐高渗透压等缺点，而且，发酵原料对发酵转化率、发酵产量、产物质量及生产成本均具有显著影响，发酵液成分复杂、杂质多、分离提纯难度大也将影响产物的收率和质量，因此，在不影响产品质量的前提下，提高原料利用率，提高生产强度等技术要求是本行业亟需去解决的问题。
技术实现思路
1、为了改善常规2-酮基-d-葡萄糖酸生产工艺中原料利用率低，生产强度差的缺陷，本技术提供一种双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法。
2、本技术提供的一种双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，采用如下的技术方案：
3、一种双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其步骤为：以玉米淀粉水解糖为底物，向玉米淀粉水解糖中添加葡萄糖脱氢酶处理液及葡萄糖酸脱氢酶处理液，反应24-48h，得到2-酮基-d-葡萄糖酸。
4、优选的，所述葡萄糖脱氢酶处理液/葡萄糖酸脱氢酶处理液的制备方法为：取沙雷氏菌接种至lb液体培养基中，置于25-40℃、150-200rpm的条件下培养至菌液od值为0.6-0.8，加入诱导剂iptg至其终浓度为0.4-0.6mm，置于15-20℃、100-120rpm诱导表达16h，将培养液于4℃条件下7000-10000rpm离心5-10min收集菌体，然后将菌体重悬于缓冲液中，经破碎纯化后，加入同浓度的葡萄糖脱氢酶/葡萄糖酸脱氢酶，得到葡萄糖脱氢酶处理液/葡萄糖酸脱氢酶处理液。
5、沙雷氏菌利用特定的膜孔蛋白以协助扩散的方式摄取葡萄糖，而在葡萄糖进入周质空间后，可被膜结合的葡萄糖脱氢酶催化氧化为葡萄糖酸，之后再被膜结合的葡萄糖酸脱氢酶催化氧化为2-酮基-d-葡萄糖酸，相较于常规的生物发酵生产来说，本技术的双酶协同生产方式具有更高的原料利用率，进而提高生产强度。
6、优选的，所述葡萄糖脱氢酶处理液及葡萄糖酸脱氢酶处理液为依次加入，具体为，先加入葡萄糖脱氢酶处理液，反应12-24h，再加入葡萄糖酸脱氢酶处理液，继续反应12-24h。
7、相对于将葡萄糖脱氢酶处理液及葡萄糖酸脱氢酶处理液混合添加来说，将葡萄糖脱氢酶处理液及葡萄糖酸脱氢酶处理液依次加入的方式可以促使葡萄糖有序且准确地依次转化为葡萄糖酸及2-酮基-d-葡萄糖酸。
8、优选的，所述葡萄糖酸脱氢酶处理液与所述葡萄糖脱氢酶处理液的摩尔浓度比为1：（90-110）。
9、优选的，所述葡萄糖脱氢酶处理液与所述玉米淀粉水解糖的摩尔浓度比为1：（900-1100）。
10、优选的，所述玉米淀粉水解糖浓度为10-1000g/l。
11、优选的，反应时控制底物溶液ph值介于1-10。
12、优选的，反应时控制反应温度介于20-50℃。
13、当所述葡萄糖酸脱氢酶处理液、所述葡萄糖脱氢酶处理液及玉米淀粉水解液采用上述浓度，同时控制ph值介于1-10，温度控制于20-50℃时，本技术的双酶协同生产方式具有更高的原料利用率，进而提高生产强度。
14、优选的，所述双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法采用双酶催化罐进行；
15、所述双酶催化罐包括催化罐、葡萄糖脱氢酶罐及葡萄糖酸脱氢酶罐，所述催化罐的上端面设置有驱动电机，所述驱动电机的输出端设置有主动齿轮，所述葡萄糖脱氢酶罐的外周面转动连接有从动齿轮，所述主动齿轮与所述从动齿轮相互啮合；
16、所述从动齿轮上设置有按压块一，所述按压块一的端面设置有圆弧面，所述葡萄糖酸脱氢酶罐上设置有用于启闭所述葡萄糖酸脱氢酶罐的阀门的开关一，所述从动齿轮驱使所述按压块一与所述开关一抵接。
17、在葡萄糖脱氢酶添加完毕后，驱动电机开始运行，驱动电机驱使主动齿轮发生旋转，主动齿轮带动从动齿轮发生旋转，进而进行计时，在到达指定时间后，按压块一的圆弧面与开关一抵接，进而开启葡萄糖酸脱氢酶罐的阀门，完成葡萄糖酸脱氢酶的输送，促使葡萄糖脱氢酶及葡萄糖酸脱氢酶的输送更为及时。
18、优选的，所述葡萄糖脱氢酶罐上设置有漂浮件，所述漂浮件包括漂浮板、连接杆及连接块，所述漂浮板容置于所述葡萄糖脱氢酶罐内，所述连接杆固定连接于所述漂浮板上，所述连接杆穿出所述葡萄糖脱氢酶罐并往复滑移于所述葡萄糖脱氢酶罐上，所述连接块固定连接于所述连接杆远离所述漂浮板的一端；
19、所述连接块的底部设置有按压块二，所述催化罐的顶部设置有用于启闭所述驱动电机的开关二，所述漂浮板的下移驱使所述按压块二与所述开关二抵接。
20、在葡萄糖脱氢酶添加的过程中，漂浮板在重力的作用下逐渐下移，从而带动按压块二同步下移，当葡萄糖脱氢酶添加完毕后，漂浮板触底，而按压块二恰好与开关二抵接，进而迫使驱动电机开启，进一步提高葡萄糖脱氢酶及葡萄糖酸脱氢酶输送的及时性。
21、优选的，所述主动齿轮转动连接于所述连接块的下端面，所述主动齿轮的中心开设有键槽，所述驱动电机的输出端设置有键块，所述键块活动插接于所述键槽内。
22、在按压块二与开关二抵接之前，键块首先插接于键槽内，从而促使驱动电机可以通过键块及键槽带动主动齿轮发生旋转，而上述设置可以起到双重保险的作用，在误触开关二后，由于主动齿轮的安装还未到位，从动齿轮将难以发生运行。
23、优选的，所述连接块与所述从动齿轮之间始终存在间隙，所述按压块一的侧壁设置有导向面，所述导向面迫使所述连接块向远离所述从动齿轮的方向移动。
24、在葡萄糖酸脱氢酶添加完毕后，按压块一逐渐脱离开关一，此时，导向面将与连接块抵接，从而促使连接块在导向面的作用下逐渐上移，进而迫使按压块二逐渐脱离开关二，进而完成驱动电机的关闭操作。
25、综上所述，本技术具有以下有益效果：
26、沙雷氏菌利用特定的膜孔蛋白以协助扩散的方式摄取葡萄糖，而在葡萄糖进入周质空间后，可被膜结合的葡萄糖脱氢酶催化氧化为葡萄糖酸，之后再被膜结合的葡萄糖酸脱氢酶催化氧化为2-酮基-d-葡萄糖酸，相较于常规的生物发酵生产来说，本技术的双酶协同生产方式具有更高的原料利用率，进而提高生产强度。
27、2、相对于将葡萄糖脱氢酶处理液及葡萄糖酸脱氢酶处理液混合添加来说，将葡萄糖脱氢酶处理液及葡萄糖酸脱氢酶处理液依次加入的方式可以促使葡萄糖有序且准确地依次转化为葡萄糖酸及2-酮基-d-葡萄糖酸。
28、3、当所述葡萄糖酸脱氢酶处理液、所述葡萄糖脱氢酶处理液及玉米淀粉水解液采用上述浓度，同时控制ph值介于1-10，温度控制于20-50℃时，本技术的双酶协同生产方式具有更高的原料利用率，进而提高生产强度。
1.一种双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于，其步骤为：以玉米淀粉水解糖为底物，向玉米淀粉水解糖中添加葡萄糖脱氢酶处理液及葡萄糖酸脱氢酶处理液，反应24-48h，得到2-酮基-d-葡萄糖酸。
2.根据权利要求1所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶处理液/葡萄糖酸脱氢酶处理液的制备方法为：取沙雷氏菌接种至lb液体培养基中，置于25-40℃、150-200rpm的条件下培养至菌液od值为0.6-0.8，加入诱导剂iptg至其终浓度为0.4-0.6mm，置于15-20℃、100-120rpm诱导表达16h，将培养液于4℃条件下7000-10000rpm离心5-10min收集菌体，然后将菌体重悬于缓冲液中，经破碎纯化后，加入同浓度的葡萄糖脱氢酶/葡萄糖酸脱氢酶，得到葡萄糖脱氢酶处理液/葡萄糖酸脱氢酶处理液。
3.根据权利要求2所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶处理液及葡萄糖酸脱氢酶处理液为依次加入，具体为，先加入葡萄糖脱氢酶处理液，反应12-24h，再加入葡萄糖酸脱氢酶处理液，继续反应12-24h。
4.根据权利要求3所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖酸脱氢酶处理液与所述葡萄糖脱氢酶处理液的摩尔浓度比为1：（90-110）。
5.根据权利要求4所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶处理液与所述玉米淀粉水解糖的摩尔浓度比为1：（900-1100）。
6.根据权利要求5所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：反应时控制底物溶液ph值介于1-10，控制反应温度介于20-50℃。
7.根据权利要求1所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法采用双酶催化罐（1）进行；
8.根据权利要求7所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶罐（2）上设置有漂浮件（24），所述漂浮件（24）包括漂浮板（241）、连接杆（242）及连接块（243），所述漂浮板（241）容置于所述葡萄糖脱氢酶罐（2）内，所述连接杆（242）固定连接于所述漂浮板（241）上，所述连接杆（242）穿出所述葡萄糖脱氢酶罐（2）并往复滑移于所述葡萄糖脱氢酶罐（2）上，所述连接块（243）固定连接于所述连接杆（242）远离所述漂浮板（241）的一端；
9.根据权利要求8所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述主动齿轮（12）转动连接于所述连接块（243）的下端面，所述主动齿轮（12）的中心开设有键槽（14），所述驱动电机（11）的输出端设置有键块（15），所述键块（15）活动插接于所述键槽（14）内。
10.根据权利要求9所述的双酶催化生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述连接块（243）与所述从动齿轮（21）之间始终存在间隙，所述按压块一（22）的侧壁设置有导向面（25），所述导向面（25）迫使所述连接块（243）向远离所述从动齿轮（21）的方向移动。
