本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种基于kasp技术检测基因编辑大豆的引物和方法。
背景技术：
1、大豆是人类主要油脂和蛋白质的来源，是世界最重要的经济作物之一，也是人类植物油和植物性蛋白的主要来源。随着生活水平的提高以及饮食结构的改善，人们对优质大豆油的需求日益增长，培育高品质大豆成为大豆育种的重要目标之一。基因编辑大豆，是一种复合性状的非转基因作物。与传统大豆相比，这种大豆富含单不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸含量减少60%，压榨出来的大豆油不含反式脂肪酸。
2、基因编辑技术包括zfn、tanlen、crispr等技术。crispr技术因其方法简单、成本低等优点越来越成为主流技术，并被成功应用到动物、植物和微生物的不同种类的物种中。基因编辑技术不仅可以突破传统育种难以解决的遗传障碍，而且能实现特定性状的精准改变，颠覆已有的动植物遗传改良技术路径和选育效率。伴随基因编辑技术的不断改进及其在动植物上的广泛应用，世界各地的研究人员已对不同物种的植物和动物的基因组进行了大量编辑，创制了新的变异，推动了动植物育种的进程。
3、kasp(竞争性等位基因特异性pcr，即kompetitive allele-specific pcr)技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对snp分型以及检测indels(insertions and deletions，插入和缺失)。该项技术优点是：其一，只要合成两个通用荧光探针，两个通用淬灭探针，再加合成多个针对具体位点的snp pcr引物，就可以测许多位点；其二，因为荧光探针、和淬灭探针都很贵，kasp方法相比于taqman方法，可以通过通用荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本。
4、本发明提供了一种基于kasp技术检测基因编辑大豆的引物和方法，对基因编辑后的基因编辑大豆基因位点进行等位基因的鉴别和筛选，进行特定有利基因的转移和聚合，节省成本，同时增加选择的准确性和效率。
技术实现思路
1、本发明目的是在于提供了一种快速简便的基于kasp技术检测大豆基因型的引物和方法。其具有特异性高、灵敏度高的特点，且成本较低，检测周期短，有良好的应用前景。
2、一方面，本发明提供了一种用于检测基因编辑大豆的kasp引物组，所述引物组选自以下（i）-(ii)任意一组或几组：
3、（i）第一引物组，包括第一特异引物，第二特异引物和第一通用引物，所述第一特异引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述第二特异引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述第一通用引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；
4、（ii）第二引物组，包括第三特异引物、第四特异引物和第二通用引物，所述第三特异引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述第四特异引物的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述第二通用引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
5、在一个实施方式中，所述基因编辑大豆为gmfad2基因经基因编辑后得到的基因编辑大豆；所述gmfad2基因包括gmfad2-1a和gmfad2-1b；所述基因编辑大豆的gmfad2-1a的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述基因编辑大豆的gmfad2-1b的核苷酸序列如seq idno.10所示。
6、在一个实施方式中，所述第一引物组用于检测gmfad2-1a基因，所述第二引物组用于检测gmfad2-1b基因。
7、在一个实施方式中，所述野生型gmfad2-1a基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述野生型gmfad2-1b基因的核苷酸序列如seq id no.9所示。
8、在一个实施方式中，所述特异引物的5’端还连接有荧光标签，所述荧光标签为fam，hex等；优选的，所述荧光标签为fam或hex，所述fam荧光标签的碱基序列为gaaggtgaccaagttcatgct，所述hex荧光标签的碱基序列为gaaggtcggagtcaacggatt。
9、另一方面，本发明提供了一种检测基因编辑大豆的方法，所述方法包括利用上述kasp引物组对待测样品进行检测的步骤。
10、在一个实施方式中，所述方法还包括从样品中获得核酸的步骤。
11、在一个实施方式中，所述基因编辑大豆为gmfad2基因经过基因编辑后得到的基因编辑大豆基因编辑大豆。
12、所述gmfad2基因包括gmfad2-1a和gmfad2-1b。
13、在一个实施方式中，所述kasp反应的反应条件：94℃预变性，15min；第一步扩增反应，94℃变性20 s；61℃~55℃退火并延伸60s，10个touch down循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应94℃变性20 s，55℃退火并延伸60 s，26个循环。
14、在一个实施方式中，所述检测基因编辑大豆的方法包括采用kraken软件对pcr产物荧光信号的差异进行检测，进而鉴别出每个待测基因编辑大豆的基因型。
15、在一个实施方式中，所述检测基因编辑大豆kasp基因分型结果的方式包括lgc设备读取，酶标仪读取，琼脂糖凝胶电泳等其他方法，本实验中优先选用lgc设备读取。
16、在一个实施方式中，所述检测基因编辑大豆的基因型为检测gmfad2-1a基因的基因型，所述编辑后纯合基因型为“tt”，所述野生型纯合基因为“aa”，所述杂合编辑型基因为“at”。
17、在一个实施方式中，所述检测基因编辑大豆的基因型为检测gmfad2-1b基因的基因型，所述编辑后的纯合基因型为“缺失7bp”，所述野生型纯合基因型为“未缺失7bp”，所述杂合编辑型基因型为“缺失7bp与未缺失”。
18、在一个实施方式中，所述第一引物组的引物在同一个扩增体系下进行扩增和检测，或者，所述第二引物组的引物在同一个扩增体系下进行扩增和检测，在其他的实施方式中，所述第一引物组和第二引物组在同一个扩增体系下进行扩增和检测。
19、在一个实施方式中，所述待测样品来源于大豆的植物部分，例如，叶片、荚果、种子或根茎。
20、另一方面，本发明提供了一种检测大豆基因型的试剂盒，所述试剂盒包括上述的kasp引物组。
21、另一方面，本发明提供了上述kasp引物组在检测基因编辑大豆基因型中的用途。
22、另一方面，本发明还提供了将上述kasp引物组在制备用于检测基因编辑大豆基因型的试剂或试剂盒中的用途。
23、在一个实施方式中，所述大豆为上述的基因编辑大豆。
24、发明的有益效果
25、本发明提供了一种基于kasp技术检测基因编辑大豆的引物和方法，可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率和精确度，实现了高通量、低成本快速检测功能基因的目的，为育种家筛选优异等位基因的大豆品种提供了方便，加快了育种的进程。
26、下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
27、本技术涉及的序列信息如下：
28、
1.一种用于检测基因编辑大豆的kasp引物组，其特征在于，所述引物组选自以下（i）-（ii）任意一组或几组：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述基因编辑大豆为gmfad2基因经基因编辑后得到的基因编辑大豆基因编辑大豆；所述gmfad2基因包括gmfad2-1a和gmfad2-1b；所述基因编辑大豆的gmfad2-1a的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述基因编辑大豆的gmfad2-1b的核苷酸序列如seq id no.10所示。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述第一引物组用于检测gmfad2-1a基因，所述第二引物组用于检测gmfad2-1b基因。
4.根据权利要求1-3任一所述的引物组，其特征在于，所述野生型gmfad2-1a基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述野生型gmfad2-1b基因的核苷酸序列如seq id no.9所示。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述特异引物的5’端还连接有荧光标签。
6.一种检测基因编辑大豆的方法，所述方法包括利用权利要求1-5任一所述的kasp引物对待测样品进行检测的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述kasp反应的反应条件：94℃预变性，15min；第一步扩增反应，94℃变性20 s；61℃~55℃退火并延伸60s，10个touch down循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应94℃变性20 s，55℃退火并延伸60s，26个循环。
8.根据权利要求6-7任一所述的方法，其特征在于，所述待测样品来源于大豆的植物部分。
9.一种用于检测大豆基因型的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-5任一所述的kasp引物组。
10.权利要求1-5任一所述的kasp引物组在检测基因编辑大豆基因型中的用途，或者在制备用于检测基因编辑大豆基因型的试剂或试剂盒中的用途。
