本公开涉及靶分子的分离领域，并且涉及包含多个色谱颗粒的分离基质，每个色谱颗粒包含芯和围绕芯的层，其设计使得靶分子被排除通过芯的孔隙扩散，同时允许靶分子至少部分地通过围绕芯的层的孔隙扩散。进一步公开了一种用于制备这种分离基质的方法、这种分离基质的用途以及通过使用这种分离基质来分离靶分子的方法。特别是，公开了一种用于将完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳与未完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，以及通过所述方法获得的组合物，包括药物组合物，以及这种组合物的用途。
背景技术：
1、色谱中的峰展宽受到色谱中存在的不同类型扩散的影响。van deemter描述了影响色谱中峰展宽的三个不同项，即a、b和c项(参见例如t.edge或p.j.marriott)。a项为所谓的“涡流扩散”，并且区域展宽与通过非理想堆积的通道有关。b项为纵向扩散，纵向扩散的一个实例为分析物在色谱系统毛细管中的扩散。纵向扩散更适用于低分子量分子，因为它们在液体中的扩散速率比大蛋白高得多。在色谱系统中具有低死体积以减少纵向扩散是重要的。c项扩散为由流动相和固体载体之间的传质阻力引起的。发生扩散是因为分析物扩散进出孔隙，并且距离越长(粒度越大)，分析物的稀释度越大，并且此外会出现峰展宽。增加的流速也助于峰展宽，因为进入到孔隙中的扩散速率为恒定的，并且增加的流速将进一步分离分析物。
2、为优化与特定靶分子纯化相关的过程，将需要独特的操作条件，并且最佳分离基质将因情况而异。需要设计特定的工艺来纯化肽和蛋白、核酸、病毒颗粒等。在抗体的纯化中，抗体的类型对于分离基质的选择是决定性的。不同血清型的腺相关病毒同样如此。
3、腺相关病毒(aav)为非包膜病毒，其具有线性单链dna(ssdna)基因组并且可设计改造为将dna递送至靶细胞。重组腺相关病毒(raav)载体已成为最通用且最成功的基因疗法递送媒介物之一。使用病毒载体进行基因疗法的需求日益增加。aav载体为用于开发针对肌肉疾病以及其他障碍的新型基因疗法的最有吸引力的基因转移工具之一。大多数早期的aav基因转移研究使用aav血清型2(aav2)。为进一步改善aav介导的基因转移的效率和特异性，已通过病毒基因组设计改造和/或衣壳修饰开发出许多aav血清型和变体。近年来，血清型如aav8和aav9的使用有所增加。靶器官决定血清型的选择。为在疗法中使用aav颗粒作为载体，有必要在转染之后从细胞杂质如dna中纯化病毒颗粒。超速离心是高效的但不可扩展。通常，使用若干过滤步骤和若干色谱步骤来从细胞培养物中分离aav颗粒(参见例如，weihong qu等人)。
4、aav载体的治疗功效取决于完整包装有感兴趣遗传物质的病毒颗粒的高百分比。上游表达系统递送完整包装的aav颗粒(含有感兴趣的遗传物质)、空的aav颗粒和部分包装有感兴趣遗传物质的aav颗粒以及杂质的混合物。因此需要在纯化过程中富集完整包装的aav颗粒。然而，关于实现完整包装的和空的腺相关病毒衣壳的有效且可扩展的分离，存在若干挑战，比如：
5、-衣壳(血清型和变体)的巨大多样性和完整衣壳产率方面的细胞培养差异，这意味着需要广泛的优化来纯化腺相关病毒的每种血清型或变体。
6、-在完整包装的和空衣壳之间关于与纯化相关的若干参数(例如等电点)差异小；
7、-除完整包装的和空的衣壳之外，感染的宿主细胞中还产生部分包装的衣壳变体。有迹象表明，这种部分包装的并因此治疗效果较差的衣壳可与完整包装的衣壳部分地共洗脱。
8、因此，在该领域中仍然需要替代性分离基质来提供新型色谱材料和纯化策略，以提高纯化过程的速度、提高分辨率和降低成本，并提供用于不同类型靶分子的下游处理的大规模方法。
技术实现思路
1、本公开的目的为提供一种色谱材料，其可适用于靶分子分离的大规模方法，并在工业制备色谱中实现提高的分辨率。目前公开的色谱材料的主要应用领域为分离方法的精制(polishing)步骤，也称为二次或最终纯化。
2、更特别地，本公开的第一方面涉及一种包含多个色谱颗粒的分离基质，每个色谱颗粒包括芯和围绕芯的层，
3、其中芯具有第一平均孔径和围绕芯的层具有第二平均孔径，其中第二平均孔径为第一平均孔径的至少1.5倍大，
4、其中第一平均孔径排除靶分子通过芯的孔隙扩散并且其中第二平均孔径至少部分地允许靶分子通过围绕芯的层的孔隙扩散。
5、本公开的第二方面涉及一种用于制备根据第一方面的分离基质的方法，方法包括制备多个色谱颗粒。
6、本公开的第三方面涉及根据第一方面的分离基质用于制备应用、比如用于从细胞培养收获物或杂质中分离靶分子的用途。
7、本公开的第四方面涉及一种用于将一种或多种靶分子与液体样品中的一种或多种其他化合物分离的制备色谱方法，其方法包括使包含靶分子和化合物的流动相与根据本公开第一方面的分离基质接触。
8、本公开的第五方面涉及一种用于将一种或多种靶分子与液体样品中的一种或多种其他化合物分离的特定制备色谱方法。更具体地讲，公开了一种用于将完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳与未完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，方法包括以下步骤：
9、a)将包含腺相关病毒衣壳的液体样品添加到弱阳离子交换色谱材料，
10、其中液体样品包含纯度为至少90％和浓度为至少1012个腺相关病毒衣壳/ml的腺相关病毒衣壳，其中至少10％的腺相关病毒衣壳为完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳，
11、其中弱阳离子交换色谱材料包含：
12、i.用于与腺相关病毒衣壳结合的配体；或
13、ii.载体，其包含如上所述的根据本公开第一方面的分离基质；
14、b)从色谱材料洗脱完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳；
15、其中将步骤(b)中洗脱的腺相关病毒衣壳洗脱成洗脱物级分，其合并的洗脱物级分包含步骤(a)中添加的液体样品的腺相关病毒衣壳的至少50％，其中至少60％的腺相关病毒衣壳完整包装有遗传物质。
16、以上公开的根据第五方面的方法可进一步包括使步骤(b)中洗脱的包含完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳的洗脱物级分经受以下步骤中的一个或多个：
17、c1)将腺相关病毒衣壳浓缩至药物相关剂量，
18、c2)用药学上可接受的缓冲液替换权利要求1的步骤(b)中施用的缓冲液，和/或
19、c3)将包含腺相关病毒衣壳的洗脱物级分灭菌，从而获得包含腺相关病毒衣壳的药物组合物。
20、本公开的第六方面涉及一种包含通过进行上述根据第五方面的方法获得的腺相关病毒衣壳的组合物，在其组合物中完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳与未完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳的比率为至少3:2。
21、以下在详细描述和从属权利要求中描述本公开的优选方面。
1.一种包含多个色谱颗粒(10)的分离基质，每种色谱颗粒(10)包含芯(20)和围绕芯(20)的层(30)，其中芯(20)具有第一平均孔径和围绕芯(20)的层(30)具有第二平均孔径，其中第二平均孔径为第一平均孔径的至少1.5倍大，
2.根据权利要求1的分离基质，其中第一平均孔径排除分子量为约50kda，比如约140kda，比如约2000kda的靶分子扩散。
3.根据权利要求1或2的分离基质，其中第一平均孔径排除流体动力学直径为约7nm、比如约10nm、比如约20nm、比如约25nm的靶分子扩散。
4.根据前述权利要求中任一项的分离基质，其中色谱颗粒(10)具有约20μm-约500μm，比如约60μm-约120μm、或比如约100μm-约400μm的直径。
5.根据前述权利要求中任一项的分离基质，其中芯(20)具有色谱颗粒(10)直径的约60％-约97％的直径。
6.根据前述权利要求中任一项的分离基质，其中围绕芯(20)的层(30)具有色谱颗粒(10)直径的3％-约40％，比如约6％-约10％的直径。
7.根据前述权利要求中任一项的分离基质，其中色谱颗粒(10)包含用于结合于靶分子的配体，其中所述配体位于围绕芯(20)的层(30)和任选地其中所述配体另外位于芯(20)。
8.根据前述权利要求的分离基质，其中所述配体为阳离子配体、阴离子配体、疏水相互作用配体、多峰配体或其组合。
9.根据权利要求7-8中任何一项的分离基质，其中所述配体经接头或延伸剂连接于色谱颗粒(10)的表面。
10.根据前述权利要求中任一项的分离基质，其中色谱颗粒(10)为基本上球形的。
11.根据前述权利要求中任一项的分离基质，其中色谱颗粒(10)是天然或合成来源，优选地为多糖，比如琼脂糖。
12.根据前述权利要求中任一项的分离基质，其中围绕芯(20)的(30)层为第一层并且色谱颗粒(10)进一步包含围绕第一层(30)的第二层(40)，
13.根据前述权利要求中任一项的分离基质，其中芯(20)包含聚合化合物，其与围绕芯(20)的层(30；40)的平均孔径相比较减小芯(20)的平均孔径；任选地其中所述聚合化合物为天然聚合物，比如葡聚糖，或合成聚合物。
14.一种用于制备根据权利要求1-13中任何一项的分离基质的方法，所述方法包括制备多个色谱颗粒(10)，其包含：
15.根据权利要求14的方法，其中所述步骤(b)的添加包括：
16.根据权利要求1-13中任何一项的分离基质用于制备应用、比如用于从细胞培养收获物或杂质中分离靶分子的用途。
17.根据前述权利要求的用途，其中所述靶分子为腺相关病毒衣壳、单克隆抗体、抗体的抗原结合片段、病毒样颗粒、慢病毒衣壳、腺病毒衣壳或流感病毒衣壳。
18.一种用于将一种或多种靶分子与液体样品中的一种或多种其他化合物分离的制备色谱方法，其方法包括使包含所述靶分子和化合物的液体样品与根据权利要求1-13中任何一项的分离基质接触，并且其方法包括使所述液体样品暴露于<5bar、比如<3bar的压力。
19.根据前述权利要求的方法，其包括在使所述包含靶分子和化合物的液体样品与所述分离基质接触的步骤之前的澄清和/或色谱步骤。
20.一种用于将完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳与未完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，所述方法包括以下步骤：
21.根据权利要求20的方法，其中所述弱阳离子交换色谱材料的配体由以下式i定义：
22.根据权利要求21的方法，其中x1为o和n为1；或x1为s和n为2；并且每一个r1和r2为氢。
23.根据权利要求21或22的方法，其中所述配体的密度为每ml所述弱阳离子交换色谱材料约30-约110μmol，比如约40-约90μmol、比如约50-约80μmol的配体。
24.根据权利要求20-23中任何一项的方法，其进一步包括使权利要求20的步骤(b)中洗脱的所述包含完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳的洗脱物级分经受以下步骤中的一个或多个：
25.一种包含通过进行权利要求20-24中任何一项的方法得到的腺相关病毒衣壳的组合物，在其组合物中所述完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳与未完整包装有遗传物质的腺相关病毒衣壳的比率为至少3:2，优选地为至少4:1。
