1.本发明属于寡核苷酸建库技术领域，具体地，涉及一种基于磁珠的寡核苷酸库归一化方法和试剂盒。
背景技术：2.化学合成的dna寡核苷酸(oligonucleotides，oligos)是基因组学、生物物理学、生物纳米技术和生物技术领域的重要试剂。oligos是生物核酸扩增、富集、检测、测序的引物和探针，也是自组装纳米级材料的构建块，具有纳米级精度。现代研究的进展使用了越来越多的寡核苷酸集群：在基因组学中，一个完整的外显子捕获panel可能包含超过30万个寡核苷酸，每个寡核苷酸长度约为100nt，甚至小的疾病特异性目标panel经常包含数百个引物或探针寡核苷酸。
3.在临床应用中往往要求寡核苷酸库的不同寡核苷酸之间具有浓度均一或一定比例关系。现有的常规归一化混库方法，可以分为定量-计算-吸取三个步骤。通过吸光度值定量寡核苷酸，计算不同寡核苷酸的浓度，从而吸取等量或等比例的寡核苷酸完成归一化混库。然而通过吸光值计算浓度会受其他各种杂质的影响，并且费力费时。例如针对仅包含数百个探针寡核苷酸的小panel，定量使用不同的仪器平台，至少需要1-3个小时不等；计算环节，需要根据寡核苷酸浓度与比例关系计算具体的吸取量，耗时约1个小时；从每个寡核苷酸中独立吸取相应体积来实现归一化，此过程需要1-3个小时。因此按照现有的技术流程，小panel的寡核苷酸库归一化的过程需要4-7个小时。然而一个完整的外显子捕获panel可能包含超过30万个寡核苷酸，采用现有技术流程就更加耗费时间与人工。
4.当前液相捕获技术使用的探针寡核苷酸5'端标记生物素，用于链霉亲和素磁珠捕获，但生物素标记方法大多数是在已归一化的寡核苷酸5'端修饰生物素，实验前还需扩增寡核苷酸库，而合成与扩增过程均会引入错误碱基，得到的寡核苷酸库含有错误序列，会导致捕获非特异性区域，降低捕获效率。
技术实现要素：5.为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采取的技术方案如下：
6.本发明第一方面提供一种基于磁珠的寡核苷酸库归一化方法，包括以下步骤：
7.s1，获得携带有生物素标记的多种寡核苷酸；
8.s2，将链霉亲和素磁珠利用磁珠结合液稀释制备磁珠悬液，按照混库比例要求吸取所述磁珠悬液置于不同的容器中；
9.s3，将步骤s1获得的所述多种寡核苷酸加入至相应的步骤s2准备的含有磁珠悬液的容器中，室温混匀进行结合；
10.s4，用磁力架分离磁珠，去除上清；
11.s5，重悬磁珠并将所有容器中的磁珠混合，将磁珠清洗后，加入ddh2o混匀磁珠，65℃3～10分钟，用磁力架分离，取上清，即为归一化的寡核苷酸库。
12.在本发明的一些实施方案中，步骤s1中，寡核苷酸序列合成包括去保护、碱基偶联、加帽和氧化4个步骤，在寡核苷酸序列合成完毕后，增加额外的去保护与碱基偶联步骤，将常规碱基单体替换为生物素亚磷酰胺单体，从而引入生物素标记。
13.在本发明的一些实施方案中，所述磁珠结合液的组分为：ph 7.5的tris-hcl 40mm，edta 4mm，nacl 4m。
14.在本发明的一些实施方案中，步骤s2中，所述链霉亲和素磁珠在用磁珠结合液稀释之前，还包括利用磁珠清洗液进行清洗的步骤，其中，所述磁珠清洗液的组分为：ph 7.5的tris-hcl 5mm，edta 0.5mm，nacl 1m。
15.在本发明的一些实施方案中，步骤s5中，具体步骤为：利用磁珠清洗液重悬磁珠，混合所有磁珠，用磁力架分离，并弃上清；磁珠结合液冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用10mm tris-hcl冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用ddh2o冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
16.进一步地，利用磁珠清洗液、磁珠结合液、10mm tris-hcl或ddh2o清洗两次或更多。如此，可以进一步提高寡核苷酸库的纯度。
17.本发明第二方面提供利用本发明第一方面所述的寡核苷酸库归一化方法得到的寡核苷酸库。
18.本发明第三方面提供一种基于磁珠的寡核苷酸库归一化试剂盒，所述试剂盒包括寡核苷酸合成试剂、生物素和链霉亲和素磁珠。
19.在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括磁珠清洗液和/或磁珠结合液。
20.进一步地，所述磁珠清洗液的组分为：ph 7.5的tris-hcl 5mm，edta 0.5mm，nacl 1m。
21.进一步地，所述磁珠结合液的组分为：ph 7.5的tris-hcl 40mm，edta 4mm，nacl 4m。
22.在本发明中，寡核苷酸是指2～10核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段，本发明在使用这一术语时，对核苷酸残基的数目并无严格限定。
23.在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸为探针，由此可以制备探针库，进一步用于杂交捕获测序，获得目标区域的序列信息。
24.在本发明的另一些实施方案中，所述寡核苷酸为引物，由此获得生物素标记的多个扩增引物归一化混库，以获得含生物素标记的多个扩增子产物。
25.本发明的有益效果
26.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
27.发明的归一化方法方便快捷，可以在120分钟内，完成寡核苷酸的归一化混库，并可实现自动化操作。
28.本发明合成过程中生成的缺失寡核苷酸5’端乙酰化，不能连接生物素亚磷酰胺单体，通过链霉亲和素磁珠特异性捕获生物素标记的完整寡核苷酸，最终能获得归一化的完美寡核苷酸库，得到纯度较高的捕获探针。
29.本发明主要使用链霉亲和素磁珠，试剂成本较低，且探针产量较高，10μg链霉素亲和素磁珠最高可以4pmol携带一个生物素标记的寡核苷酸，单次归一化混库的探针至少可完成3000次杂交捕获反应。
30.本发明对于靶向测序的生物素修饰探针制备生产具有较高的应用价值，适于推广应用。
附图说明
31.图1示出了寡核苷酸合成过程示意图。
32.图2示出了寡核苷酸生物素标记情况，未与生物素结合的为不完整寡核苷酸。
33.图3示出了将标记有生物素的寡核苷酸和链霉亲和素磁珠结合、清洗掉过量的dna，从而实现归一化混库的流程图。
34.图4示出了聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：孔道1是归一化前的寡核苷酸探针；孔道2是上清未结合的寡核苷酸探针；孔道3是归一化后的寡核苷酸库探针。
35.图5示出了归一化前后寡核苷酸捕获位点覆盖度。
具体实施方式
36.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。
37.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。
38.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由
……
组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由
……
组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
39.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
40.实施例
41.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下
述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
42.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
43.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
44.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
45.实施例196个寡核苷酸等量混库
46.1.携带生物素标记的寡核苷酸合成
47.结合图1，携带生物素标记的寡核苷酸合成步骤如下：
48.(1)去保护：酸催化去除dmt(二甲氧基三苯基甲基)基团，以便下一轮碱基(da、dc、dg和dt)添加。
49.(2)碱基偶联：将含有dmt保护基团护的亚磷酰胺通过四唑活化剂加到未保护的5'-oh末端。
50.(3)加帽：将游离的5'-oh乙酰化，以防止进一步的链延伸所造成的单碱基缺失。
51.(4)氧化：通过碘液将磷酸三酯氧化为磷酸盐，进入一个反应循环。
52.(5)重复步骤(1)-(4)，直至寡核苷酸序列合成完毕，之后再额外的去保护与碱基偶联步骤，通过将常规碱基单体替换为生物素亚磷酰胺单体来引入生物素，然后通过氨水切割寡核苷酸。
53.经过上述步骤，大部分合成的寡核苷酸携带有生物素标记，而合成缺失的寡核苷酸由于5'-oh乙酰化不能携带生物素标记，如图2所示。
54.利用该合成步骤，合成96种携带生物素标记的120nt寡核苷酸，单个浓度大于1μm。
55.2.链霉亲和素磁珠的清洗
56.磁珠清洗液：5mm tris-hcl(ph 7.5)，0.5mm edta，1m nacl。
57.涡旋混匀室温平衡30分钟以上的链霉亲和素磁珠；用磁力架分离100μl磁珠(10mg/ml)，去除上清，用500μl磁珠清洗液冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。
58.3.寡核苷酸归一化建库
59.以下步骤结合图3介绍利用链霉亲和素磁珠实现归一化混库的方法。
60.3.1链霉亲和素磁珠结合
61.磁珠结合液：40mm tris-hcl(ph 7.5)，4mm edta，4m nacl。
62.用1000μl磁珠结合液重悬磁珠，并各取10μl磁珠重悬液到96孔板中。
63.向含磁珠重悬液的96孔中分别加入30μl的96个寡核苷酸，每个孔中加入1个寡核苷酸，室温混匀20分钟。此时，链霉亲和素磁珠与生物素结合，如图3所示。
64.用磁力架分离磁珠，去除上清，如此去除未携带生物素的寡核苷酸以及多余的携带生物素的寡核苷酸。
65.3.2结合磁珠清洗
66.磁珠清洗液重悬磁珠，混合所有磁珠，用磁力架分离，并弃上清。磁珠结合液冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
67.用10mm tris-hcl冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用ddh2o冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
68.3.3结合磁珠洗脱
69.加入40μl ddh2o混匀磁珠，65℃5分钟，用磁力架分离，取上清，即为归一化的寡核苷酸库探针。
70.使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测归一化前后的寡核苷酸库探针，如图4所示，寡核苷酸库在归一化后完整寡核苷酸比例明显增加，表明不携带生物素标记的缺失寡核苷酸可以通过基于磁珠的寡核苷酸库的归一化方法去除，得到纯度更高的寡核苷酸库探针。
71.同时该归一化方法单个探针的产量较高，探针缓冲液为ddh2o，可以低温保存并直接使用。一般捕获反应探针用量约500amol/probe/capture，预计每轮归一化至少可支持3000次杂交捕获反应。不同寡核苷酸投入量与产量见表1。
72.表1
73.寡核苷酸ssdna-1ssdna-2ssdna-3寡核苷酸投入量30pmol22.5pmol15pmol结合磁珠用量10μg7.5μg5μg寡核苷酸产量4pmol3pmol2pmol
74.实施例22组96个寡核苷酸不同比例混库
75.利用实施例1的方法合成2组不同的96种携带生物素标记的120nt寡核苷酸，单个浓度大于1μm。
76.链霉亲和素磁珠的清洗与稀释：涡旋混匀室温平衡30分钟以上的链霉亲和素磁珠；用磁力架分离150μl磁珠(10mg/ml)，去除上清，用500μl磁珠清洗液冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。
77.链霉亲和素磁珠的重悬：用1500μl磁珠结合液重悬磁珠，并向第1个96孔板中加入10μl磁珠重悬液，向第2个96孔板中加入5μl磁珠重悬液。
78.向第1个96孔中分别加入30μl的前1组96个寡核苷酸，向第2个96孔中分别加入15μl的后1组96个寡核苷酸，室温混匀20分钟。
79.用磁力架分离磁珠，去除上清。
80.结合磁珠清洗：磁珠清洗液重悬磁珠，混合所有磁珠，用磁力架分离，并弃上清。磁珠结合液冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
81.用10mm tris-hcl冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用ddh2o冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
82.加入40μl ddh2o混匀磁珠，65℃5分钟，用磁力架分离，取上清，即为归一化的寡核苷酸库探针。
83.实施例33840个寡核苷酸的归一化混库
84.合成40组不同的96种携带生物素标记的120nt寡核苷酸，单个浓度大于1μm。每4组96个寡核苷酸可完成一轮归一化混库，磁珠使用量根据归一化比例进行调整。
85.链霉亲和素磁珠的清洗与稀释：涡旋混匀室温平衡30分钟以上的链霉亲和素磁
珠；用磁力架分离400μl磁珠(10mg/ml)，去除上清，用500μl磁珠清洗液冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。
86.链霉亲和素磁珠的重悬：用2000μl磁珠结合液重悬磁珠，并向4个96孔板中加入5μl磁珠重悬液。
87.向4个96孔中分别加入15μl的4组96个寡核苷酸，室温混匀20分钟。
88.用磁力架分离磁珠，去除上清。
89.结合磁珠清洗：磁珠清洗液重悬磁珠，混合所有磁珠，用磁力架分离，并弃上清。磁珠结合液冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
90.用10mm tris-hcl冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用ddh2o冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
91.加入40μl ddh2o混匀磁珠，65℃5分钟，用磁力架分离，取上清，即为归一化的寡核苷酸库探针。
92.实施例4归一化寡核苷酸库的生物素活性验证
93.将案例3获得的寡核苷酸库进行生物素活性测试。
94.链霉亲和素磁珠的清洗与稀释：涡旋混匀室温平衡30分钟以上的链霉亲和素磁珠；用磁力架分离30μl磁珠(10mg/ml)，去除上清，用500μl磁珠清洗液冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。
95.链霉亲和素磁珠的重悬：用20μl磁珠结合液重悬磁珠。
96.加入60μl的案例3寡核苷酸库，室温混匀20分钟。
97.用磁力架分离磁珠，去除上清。磁珠结合液冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。
98.用10mm tris-hcl冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用ddh2o冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
99.加入60μl ddh2o混匀磁珠，65℃5分钟，用磁力架分离，取上清测定回收总量。
100.验证投入的寡核苷酸库总量与结合的寡核苷酸库总量接近，见表2。说明基于磁珠的寡核苷酸库的归一化方法其生物素标记具有活性功能。
101.表2
102.归一化寡核苷酸库ssdna-mix1ssdna-mix2ssdna-mix3验证投入量50pmol50pmol50pmol验证磁珠用量300μg300μg300μg验证未结合量0pmol0pmol0pmol验证结合量49.8pmol49.9pmol49.9pmol
103.实施例5归一化寡核苷酸库的捕获验证
104.将案例3获得的寡核苷酸库进行捕获验证。
105.采用kapa hype建库试剂盒以细胞系人类基因组标准品(na12878)为样本进行基因组建库。
106.按照idt xgen hybridization and wash kit说明书的操作步骤将500ng基因文库和案例3获得的寡核苷酸库进行杂交捕获，捕获文库送至测序公司进行二代测序。
107.对测序的数据进行分析，进行评价目标捕获效率target_capture_effiency和目
标脱靶率pct_off_bait参数，结果见表3。归一化寡核苷酸库的捕获效率明显高于未归一化寡核苷酸库，脱靶率明显低于未归一化寡核苷酸库。
108.表3
109.主要指标归一化寡核苷酸库未归一化寡核苷酸库targetcaptureeffiency50％37％pct_off_bait20％44％
110.对探针捕获区域位点的覆盖度进行分析，归一化寡核苷酸库的捕获位点覆盖深度在中间区域的频率更高，表明本发明对寡核苷酸库的归一化是有一定效果的，见图5。
111.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
技术特征：1.一种基于磁珠的寡核苷酸库归一化方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，获得携带有生物素标记的多种寡核苷酸；s2，将链霉亲和素磁珠利用磁珠结合液稀释制备磁珠悬液，按照混库比例要求吸取所述磁珠悬液置于不同的容器中；s3，将步骤s1获得的所述多种寡核苷酸加入至相应的步骤s2准备的含有磁珠悬液的容器中，室温混匀进行结合；s4，用磁力架分离磁珠，去除上清；s5，重悬磁珠并将所有容器中的磁珠混合，将磁珠清洗后，加入ddh2o混匀磁珠，65℃ 3～10分钟，用磁力架分离，取上清，即为归一化的寡核苷酸库。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸库归一化方法，其特征在于，步骤s1中，寡核苷酸序列合成包括去保护、碱基偶联、加帽和氧化4个步骤，在寡核苷酸序列合成完毕后，增加额外的去保护与碱基偶联步骤，将常规碱基单体替换为生物素亚磷酰胺单体，从而引入生物素标记。3.根据权利要求1所述的寡核苷酸库归一化方法，其特征在于，所述磁珠结合液的组分为：ph 7.5的tris-hcl 40mm，edta 4mm，nacl 4m。4.根据权利要求3所述的寡核苷酸库归一化方法，其特征在于，步骤s2中，所述链霉亲和素磁珠在用磁珠结合液稀释之前，还包括利用磁珠清洗液进行清洗的步骤，其中，所述磁珠清洗液的组分为：ph 7.5的tris-hcl 5mm，edta 0.5mm，nacl 1m。5.根据权利要求4所述的寡核苷酸库归一化方法，其特征在于，步骤s5中，具体步骤为：利用磁珠清洗液重悬磁珠，混合所有磁珠，用磁力架分离，并弃上清；磁珠结合液冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用10mm tris-hcl冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用ddh2o冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。6.根据权利要求5所述的寡核苷酸库归一化方法，其特征在于，利用磁珠清洗液、磁珠结合液、10mm tris-hcl或ddh2o清洗两次或更多。7.利用权利要求1所述的寡核苷酸库归一化方法得到的寡核苷酸库。8.一种基于磁珠的寡核苷酸库归一化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括寡核苷酸合成试剂、生物素和链霉亲和素磁珠。
技术总结本发明公开了一种基于磁珠的寡核苷酸库归一化方法和试剂盒，属于测序技术领域。所述方法包括以下步骤：获得携带有生物素标记的多种寡核苷酸；将链霉亲和素磁珠利用磁珠结合液稀释制备磁珠悬液，按照混库比例要求吸取所述磁珠悬液置于不同的容器中；将获得的所述多种寡核苷酸加入至相应的含有磁珠悬液的容器中，室温混匀进行结合；用磁力架分离磁珠，去除上清；重悬磁珠并将所有容器中的磁珠混合，将磁珠清洗后，加入ddH2O混匀磁珠，65℃3～10分钟，用磁力架分离，取上清，即为归一化的寡核苷酸库。本发明对于靶向测序的生物素修饰探针制备生产具有较高的应用价值，适于推广应用。适于推广应用。适于推广应用。
技术研发人员：雷文晓 李璐璐 肖晔
受保护的技术使用者：杭州联川生物技术股份有限公司
技术研发日：2022.09.02
技术公布日：2022/12/16
