5-fu损伤模型及其构建方法、参芪制剂的质量评控方法
技术领域
1.本发明涉及药物质量评控技术领域，特别涉及5-fu损伤模型及其构建方法、参芪制剂的质量评控方法。
背景技术：2.参芪制剂是由党参和黄芪两味中药，经水提加工而成的纯中药制剂，例如：参芪扶正注射液，主要作用是益气、扶正，用于肺脾气虚所引起的症状，例如神疲、乏力、少气、懒言、自汗、眩晕，临床多用于肺癌、胃癌等伴有上述症状患者的辅助治疗。临床效果表明参芪制剂能有效地提高由于化疗导致的白细胞减少，提高患者的免疫力，改善其精神状态，加速患者化疗后的恢复。
3.但是党参和黄芪来源复杂，生产工艺步骤较多，导致参芪制剂的化学成分多样，药效物质基础复杂，给其质量控制和评价增加了相当大的难度。而现有的化学定性鉴别、指纹图谱及指标性成分检测，仍难以揭示其全部有效成分或特征成分，也难以表征其理化成分与生物活性之间的相关性。因此，根据参芪制剂的具体情况，结合现代科学技术手段，探索既能够符合中医药特点的，又能在一定程度上关联临床疗效评价方法，建立具有可操作性的生物质量评控方法，保证其临床疗效的一致性和稳定性，具有重要的意义。
技术实现要素：4.基于此，本发明提供了一种用于参芪制剂的质量评控的5-fu损伤模型及其构建方法，同时还提供了一种参芪制剂的质量评控方法。使用该-fu损伤模型的参芪制剂的质量评控方法具有较高的稳定性和重现性。
5.本发明第一方面提供了一种raw264.7细胞的5-fu(5-氟尿嘧啶)损伤模型的构建方法，包括以下步骤：
6.s110：配制raw264.7细胞悬浮液和5-fu工作液：
7.s120：将raw264.7细胞悬浮液接种至培养容器中，培养；
8.s130：加入5-fu工作液，继续培养，制得5-fu损伤模型。
9.在其中一些实施例中，步骤s110中的配制raw264.7包括以下步骤：
10.s111：raw264.7细胞复苏；
11.s112：将复苏的raw264.7细胞置于细胞培养基中进行培养；
12.s113：将细胞吹打，离心，弃去上清液，转移至新鲜细胞培养基中，培养；
13.s114：细胞80％-90％融合时，弃去原细胞培养基，加入新鲜细胞培养基，刮下细胞、吹打均匀后，按1:4～1:6传代，继续培养；
14.s115：将细胞浓度调整为所需浓度，获得所述raw264.7细胞悬浮液。
15.在其中一实施例中，步骤s112中，细胞培养基为含胎牛血清、青霉素和链霉素的dmem高糖培养基；进一步地，细胞培养基为含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基。
16.在其中一实施例中，步骤s113中，以800转/min-1200转/min的转速进行离心。
17.在其中一些实施例中，步骤s113中，置于5％co2、37℃条件下培养。
18.在其中一些实施例中，步骤s115中，细胞浓度为1
×
105个/ml。
19.在其中一些实施例中，以步骤s112中，加入5ml细胞培养基计，步骤s113中离心弃去上清液后，加入2.8-3.2ml培养基，取0.8-1.2ml转移至含8.8-9.2ml的新鲜培养基中，培养；步骤s114中，弃去原细胞培养液后，加入3.8-4.2ml新鲜细胞培养液。
20.在其中一些实施例中，步骤s115中，采用新鲜细胞培养基将细胞调整到所需浓度。
21.在其中一些实施例中，步骤s120和步骤s130的培养条件为5％co2、37℃培养箱。
22.在其中一些实施例中，5-fu损伤模型的5-fu造模浓度为2μm。
23.在其中一些实施例中，5-fu损伤模型的铺板密度为10000个/孔。
24.在其中一些实施例中，5-fu损伤模型的造模时间为12-16h；进一步地，造模时间为14h、15h或16h；更进一步地，造模时间为16h。
25.本发明第二方面提供了第一方面所述方法得到的raw264.7细胞的5-fu损伤模型。
26.本发明第三方面提供了raw264.7细胞的5-fu损伤模型在参芪制剂的质量评控中的应用。
27.本发明技术人员在研究中发现：细胞毒类化疗药物通过抑制或杀伤肿瘤细胞生长达到治疗效果，这类药物对正常细胞也会造成伤害，如骨髓抑制就是化疗药物最常见的副作用之一。骨髓抑制会导致白细胞减少症的发生，直接造成患者免疫能力的下降，因此，白细胞数目常用来作为化疗药物毒性和患者对化疗方案耐受性的警示指标。
28.而临床研究表明参芪制剂能够增加白细胞计数并改善缓解白细胞减少症，对抗癌药物有显著的减毒作用，从而提高患者的免疫功能和生活质量，延长生存期，是治疗肿瘤的良好辅助药物。基于以上原因，本发明建立了单核巨噬细胞raw264.7细胞的5-fu损伤模型，模拟化疗药物对白细胞的细胞毒性作用，通过测定参芪制剂对模型中raw264.7细胞的保护作用，来评价参芪制剂的生物活性，建立一种结合临床功效和体外细胞模型的生物质量评控方法。
29.在其中一实施例中，raw264.7细胞的5-fu损伤模型如本发明第二方面所述。
30.本发明第四方面提供了一种参芪制剂的质量评控方法，包括以下步骤:
31.s210：配制参芪溶液和5-fu工作液；
32.s220：获取raw264.7细胞悬浮液；
33.s230：将所述raw264.7细胞悬浮液接种至培养容器中，培养，将所述培养容器分为参芪处理组、5-fu模型组和对照组；
34.s240：向所述参芪处理组中添加所述参芪溶液，向所述5-fu模型组中添加等量的生理盐水，向所述对照组添加等量的生理盐水，培养；
35.s250：向所述参芪处理组添加所述5-fu工作液，向所述5-fu模型组添加等量的5-fu工作液，向所述对照组加入等量的细胞培养基，培养；
36.s260：细胞培养结束后，以所述对照组为基准，计算所述参芪处理组和所述5-fu模型组的细胞存活率。
37.上述参芪扶正注射液的生物学质控方法，利用raw264.7细胞的5-fu损伤模型，评价了参芪扶正注射液对raw264.7细胞保护活性。上述方法有良好的稳定性和重现性，克服
了参芪扶正注射液单纯的化学质控不足，有助于提高参芪扶正注射液的质量可控性，保障产品的临床疗效。
38.在其中一些实施例中，步骤s210中，5-fu工作液的浓度为80mm-120mm。
39.在其中一些实施例中，步骤s210中，5-fu工作液的浓度为100mm。
40.在其中一些实施例中，步骤s210中，参芪溶液为参芪制剂配制而成，参芪制剂为口服制剂或注射制剂。
41.在其中一些实施例中，参芪溶液为参芪扶正注射液。
42.在其中一些实施例中，步骤s210中，参芪溶液包括标准参芪溶液和待测参芪溶液。
43.在其中一些实施例中，步骤s210中，包括多个浓度梯度的标准参芪溶液。
44.在其中一些实施例中，步骤s210中，参芪溶液指参芪扶正注射液原液或用生理盐水的稀释液，进一步地，测试浓度为参芪扶正注射液原液的40％～100％之间。
45.在其中一些实施例中，步骤s220同步骤s110。
46.在其中一些实施例中，步骤s230中，培养容器为细胞孔板，每个浓度重复3-10个孔；进一步地，每个浓度重复5个孔。
47.在其中一些实施例中，步骤s230中，铺板密度为5000个/孔-13000个/孔；进一步地，铺板密度为9000个/孔-11000个/孔；进一步地，铺板密度为10000个/孔。
48.在其中一些实施例中，步骤s230中，铺板密度为10000个/孔，每孔加入100μl raw264.7细胞悬浮液。
49.在其中一些实施例中，步骤s230的培养条件为：37℃、5％co2培养箱。
50.在其中一些实施例中，步骤s240中，参芪处理组包括标准参芪处理组和供试参芪处理组，以根据所述标准参芪处理组的细胞存活率，判断所述供试参芪处理组是否符合质量标准。
51.在其中一些实施例中，标准参芪处理组设置多个浓度梯度，以绘制标准曲线。
52.在其中一些实施例中，步骤s240中，参芪处理组中添加的参芪溶液的体积为15-30μl，对照组和5-fu模型组添加的生理盐水的体积为15-30μl。
53.在其中一些实施例中，步骤s240中，培养时间为7-9h。
54.在其中一些实施例中，步骤s250中，培养时间(即5-fu的造模时间)为12-16h；进一步地，培养时间为14-16h；进一步地，培养时间为16h。
55.在其中一些实施例中，参芪处理组中添加所述参芪溶液后培养7-9h；再加入5-fu工作液培养14-16h。
56.在其中一些实施例中，步骤s250中，参芪处理组中加入5-fu工作液的体积为15-30μl，5-fu模型组添加的5-fu工作液的体积为15-30μl。
57.在其中一些实施例中，所述5-fu工作液的造模浓度(即最终浓度)为2μm。
58.在其中一些实施例中，步骤s250中，向所述对照组加入等量的20μl 5％fbs的dmem培养基。
59.在其中一些实施例中，加入参芪溶液或生理盐水后，或加入5-fu工作液后，在酶标仪内震荡混匀后，放回37℃,5％co2培养箱中继续孵育。
60.在其中一些实施例，步骤s260中，细胞培养结束后，采用cck-8来进行细胞计数。
61.在其中一些实施例中，步骤s260包括以下步骤：细胞培养结束后，吸出各组的细胞
培养基，并加入cck-8的无血清细胞培养基，在培养箱中反应40～60分钟，然后于450nm处，使所述对照组的吸光度值在0.7～0.9范围内，测定各组的吸光度值，根据以下公式计算所述参芪处理组的细胞活力；
62.细胞活力(％)＝(a1–
a0)/(a2–
a0)
×
100％
63.其中，a1为所述参芪处理组的吸光度值，a2为所述fu模型组的吸光度值，a0为仅含有cck-8溶液的空白对照组的吸光度值。
64.在其中一些实施例中，上述参芪制剂的质量评控方法包括以下步骤：
65.s310：raw264.7细胞于液氮罐中取出，迅速放置37℃水浴锅中解冻，将细胞悬液加入5ml含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的dmem高糖培养基；
66.s320：将细胞吹打均匀后，以1000/min转速离心5分钟，弃去上清液，加入细胞培养基3ml，取1ml转移至含有9ml新鲜细胞培养基的养皿中，置于5％co2、37℃条件下培养；
67.s330：细胞80-90％融合时，弃去培养基，加入4ml新鲜培养基，用细胞刮刀刮下细胞，吹打均匀后按1:4～1:6传代，继续培养；
68.s340：用细胞培养基调整细胞浓度为1
×
105个/ml，移液枪轻柔混匀，在96孔板中接种细胞悬液，每孔100μl；
69.s350：每个浓度5孔重复，37℃、5％co2培养箱中培养16小时使细胞充分贴壁后，弃去旧培养基，每孔轻轻加入160μl含5％fbs的新鲜dmem培养基；
70.s360：按组别加入20μl不同浓度的标准制剂和供试批次参芪扶正注射液，对照组和5-fu模型组加入20μl生理盐水，置于酶标仪内震荡混匀，放回培养箱中培养；
71.s370：5-fu模型组和参芪处理组都加入20μl 20μm的5-fu工作液，至终浓度为2μm；ct组加入20μl 5％fbs的dmem培养基，置于酶标仪内震荡混匀，放回37℃,5％co2培养箱中继续孵育；
72.s380：16小时后，缓慢吸出培养基，沿侧壁加入100μl含10％cck-8的无血清dmem，培养箱中反应40～60分钟。酶标仪预温至37℃，震荡混匀30秒后，于450nm处测定吸光值(od)至ct组吸光度值(a)在0.7～0.9范围内。
73.在其中一些实施例中，上述参芪制剂的质量评控方法还包括采用z-vad-fmk作为阳性参照检测质量评控方法的生物效价的步骤。
74.本发明技术人员选择抗凋亡作用最广泛的z-vad-fmk作为本模型的阳性参照。因为z-vad-fmk是一种具有细胞渗透性的、不可逆的泛半胱天冬蛋白酶(pan-caspase)抑制剂，在thp.1(人单核巨噬细胞系)、jurkat(人t淋巴细胞瘤)细胞系【slee ea,zhu h,chow sc,macfarlane m,nicholson dw,cohen gm.benzyloxycarbonyl-val-ala-asp(ome)fluoromethylketone(z-vad.fmk)inhibits apoptosis by blocking the processing of cpp32,biochem.j.,1996,315,21-24.】和人源中性粒细胞【cowburn as,white jf,deighton j,walmsley sr,chilvers er.z-vad-fmk augmentation of tnf alpha-stimulated neutrophil apoptosis is compound specific and does not involve the generation of reactive oxygen species,blood,2005,105,2970-2972.】相关的细胞凋亡实验中，对外源性途径和内源性途径介导的细胞凋亡都显示出抑制作用。故可以通过该阳性对照试剂检测本发明方法的生物效价。
附图说明
75.图1为体现参芪扶正注射液在不同造模时间下对raw264.7细胞的保护作用的柱状图；
76.图2为体现参芪扶正注射液在体系不同铺板密度下对raw264.7细胞的保护作用的柱状图
77.图3为体现参芪扶正注射液在不同5-fu造模浓度下对raw264.7细胞的保护作用的柱状图；
78.图4为参芪扶正注射液s0对模型的线性考察的曲线图；
79.图5为体现不同人员对供试品s1效价测定的重复性实验的柱状图。
具体实施方式
80.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
81.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
82.以下实施例中所用到的相关试验仪器及试药如下：
83.800tsi吸收光酶标仪(美国biotek伯腾仪器有限公司)；ck x53倒置显微镜(日本olympus奥林巴斯有限公司)；countess ii细胞计数仪、forma 89000系列超低温冰箱(美国thermo fisher scientific赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；ico150恒温二氧化碳培养箱(德国memmert gmbh美墨尔特有限公司)；l530低速台式离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；5810r台式冰冻离心机、a-4-62水平工作板转子(德国eppendorf艾本德公司)；ac2-4s1生物安全柜(新加坡esco艺思高科技有限公司)；vortex genie 2涡旋仪(美国scientific industries有限公司)；万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；nunclon delta surface 96孔细胞培养板(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；细胞刮刀(美国crystalgen科晶生物科技有限公司)；加样槽(中国biosharp有限公司)；research plus微量移液器、easypet 3电动移液器(德国eppendorf公司)。
84.5-fu购于上海泰坦科技有限公司(批号：p1378516)；z-vad-fmk购于大连美伦生物技术有限公司(批号：n1125a)；青霉素/链霉素溶液(100x无菌)购于大连美伦生物技术有限公司(批号：ma0110)；dmem高糖培养基购于赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(批号：8120310)；胎牛血清购于gibco(批号：2045686cp)；cell counting kit-8(cck-8)购于大连美仑生物技术有限公司(批号：ma0218-l-nov-16f)；dmso购于赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(批号：mg160453)。
85.参芪扶正注射液由广东利民制药厂提供，(批号：201108(s0)，201110(s1)，201001(s2)，201006(s3)，201009(s4)，201013(s5)，201015(s6)，201017(s7)，201019(s8)，201103(s9)，201104(s
10
))，选择201108(s0)为标准制剂，其它为供试批次。
86.小鼠巨噬细胞raw264.7购于中国科学院细胞库。
87.实施例1参芪扶正注射液生物学质控方法的建立
88.1.药液的配制
89.5-fu工作液的配制：精密称取5-fu 10.00mg，加入dmso 769μl，充分涡旋使其溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤后得100mm 5-fu溶液，分装后在4℃下保存备用。实验时用5％fbs的dmem培养基稀释至相应工作液浓度。
90.参芪扶正注射液工作液的配制：取参芪扶正注射液，规定100.00％的原液浓度为100.00，用生理盐水做1.25倍连续稀释得到浓度为80.00、64.00、51.20、40.96、32.77的工作浓度。根据实验需求，选取不同的浓度进行实验。
91.z-vad-fmk工作液的配制：精密称取z-vad-fmk 10mg，加入100μl dmso，超声至完全溶解得100mg/ml z-vad-fmk储存液，分装保存在-20℃备用。实验时，加入预温至37℃含5％fbs的dmem培养基，使z-vad-fmk的工作液浓度为47.8μg/ml的工作液，水浴37℃中超声10min，充分涡旋后加入96孔板，按对应浓度每孔加入180μl。
92.2.5-fu造模时间的优化
93.如图1所示，当5-fu造模时间为12h时，参芪扶正注射液对raw264.7细胞没有显著的保护活性，当造模时间为14h和16h时，保护率为21.0～22.0％，没有显著性差异。考虑到后续实验的安排和实验操作的合理，选定5-fu造模时间为16h，即raw264.7细胞用参芪扶正注射液预处理8小时，加入200μm的5-fu继续培养16h后测定细胞存活率。
94.3.细胞铺板密度的优化
95.细胞在不同铺板密度下，用5-fu 200μm浓度下造模16h进行，结果如图2所示，铺板密度为5000个/孔和8000个/孔时，模型组的存活率较低，铺板密度为13000个/孔时，模型组的存活率提高到了44.6％，但是参芪扶正注射液的保护作用不明显；铺板密度为10000个/孔时，模型组的存活率为39.9％，参芪扶正注射液组的存活率为55.2％，保护率为38.3％。因此，在后续实验中将10000个/孔确定为细胞铺板密度。
96.4.5-fu造模浓度的优化
97.在最佳造模时间(16h)和铺板密度(10000个/孔)下，进一步考察5-fu造模浓度为2μm、20μm和200μm下，参芪扶正注射液对raw264.7细胞的保护作用。如图3所示，5-fu造模浓度为20μm和200μm时，模型组的存活率偏低，而浓度为2μm时，模型组的存活率在一个相对比较合理的区间，同时参芪扶正注射也体现出了对raw264.7细胞良好的保护活性，因此，在后续实验中确定2μm为5-fu的造模浓度。
98.5.日内精密度考察
99.表1、方法学日内精密度考察
[0100][0101]
(注：表1中5-fu为5-fu模型组，5-fu+sfi为参芪处理组)
[0102]
取参芪扶正注射液(s0)，考察模型方法的日内精密度，实验复6孔，重复6次，结果如表1所示。5-fu模型组rsd在1.62～7.34％，5-fu+sfi组rsd在1.52～5.64％，均《15％，可见该方法的日内精密度良好。
[0103]
6.日间精密度考察
[0104]
取参芪扶正注射液(s0)，考察模型方法的日间精密度，实验复6孔，于第1～6天进行6次实验。如表2所示，5-fu模型组的rsd为12.06％；5-fu+sfi组的rsd为8.43％，均《15％，可见该方法的日间精密度良好，满足生物评价方法的要求。
[0105]
表2、方法学日间精密度考察
[0106][0107]
(注：表2中5-fu为5-fu模型组，5-fu+sfi为参芪处理组)
[0108]
7.参芪扶正注射液对模型的线性考察
[0109]
取参芪扶正注射液(s0)，考察其对该模型保护作用的线性关系。s0原液浓度记为100.0，等比稀释4个浓度点依次为：80.0、64.0、51.2和41.0，实验重复6次，然后以对数浓度为横坐标x，细胞存活率为纵坐标y，对实验数据进行线性回归分析，如图4，实验拟合的线性方程为：y＝36.47*x
–
15.50，r2＝0.9926，可见在所设置的浓度点区间，线性关系良好。
[0110]
8.参芪扶正注射液s0的生物效价标化
[0111]
本发明采用上述建立的模型，依据《中国药典》(2020年版)第四部，1431生物检定统计法项下“量反应平行线法”，以随机设计为实验设计类型，对参芪扶正注射液s0保护5-fu损伤raw264.7细胞模型的效价进行标化。为了使以后的效价易于计算和表示，本发明首先定义参芪扶正注射液s0的生物效价为100u/μl。对z-vad-fmk进行8次效价的测定，结果见表3。
[0112]
表3、参照物效价的测定
[0113][0114][0115]
如表3所示，z-vad-fmk的8次测定效价的范围在0.7125～0.8484ng/u，平均值为0.7887ng/u，rsd为6.68％，表明在该方法下，z-vad-fmk效价稳定，满足生物效价测定的要求。
[0116]
9.方法重复性考察
[0117]
运用上述实验模型，选择s0(批号为：201108)为标准制剂，s1(批号为：201110)为供试品，根据《中国药典2020版》，1431生物检测统计法，以“量反应平行线法”项下的随机设计
为实验设计类型，对s1进行6次平行测定，以考察方法的重现性。如表4所示6次重复性实验，f(30)项回归大于7.56，偏离平行、二次曲线和反向二次曲线均小于4.17，认为通过平行性验证。
[0118]
表4、方法的重现性实验的平行性检验
[0119][0120][0121]
对供试品s1的6次平行测定的效价进行计算，结果如表5所示，供试品s1的6次平行测定的效价为95.82～113.97u/μl，平均值为102.45u/μl，rsd为6.17％，小于15％，表明该方法重现性良好，满足生物评价方法的要求，可以用于生物评价。
[0122]
表5、方法的重现性考察
[0123][0124]
10.不同人员重复性考察
[0125]
运用上述实验模型，选择s0为标准制剂，s1为供试品，两位实验人员分别对供试品s1的效价进行三次平行测定。其中实验人员a三次测定的效价平均值为98.49u/μl，rsd为2.81％，实验人员b三次测定的效价平均值为87.00u/μl，rsd为11.87％，两位实验人员实验的rsd均小于15％。如表5所示，供试品s1的效价的平均值为92.75u/μl，rsd为9.97％，该结果表明，该方法在不同人员的重复性良好(表6)。
[0126]
表6、不同人员对供试品s1效价的重复性考察
[0127][0128]
实施例2 10批参芪扶正注射液生物效价的测定
[0129]
运用上述实验模型，选择s0为标准制剂，以“量反应平行线法”对10个批次的供试品的效价进行了测定，首先对实验结果进行平行性验证，然后对供试品的效价进行计算，结果如表7所示。在所测定的10批供试品中，s5的效价最高为125.82u/μl，s4的效价最低为93.77u/μl，10批供试品效价的均值为104.61u/μl，rsd为10.88％。
[0130]
表7、10个批次的供试品的效价
[0131][0132]
实施例3参芪扶正注射液生物效价的测定方法
[0133]
小鼠巨噬细胞raw264.7到达p4+5～p4+10代后，取生长状态良好、融合度为80％左右的细胞，弃去培养液，加入4ml新鲜完全培养液，用细胞刮刀轻轻沿同一方向刮下细胞，1000rpm离心5min。将细胞重悬于1ml完全培养基，用细胞计数仪计数并记录细胞活力(活细胞比例)，要求细胞活力大于80％才能进行后续实验。用完全培养基调整细胞浓度为1
×
105个/ml，移液枪轻柔混匀，在96孔板中接种细胞悬液，每孔100μl，即1
×
104个/孔。每个浓度5孔重复，37℃、5％co2培养箱中培养16小时使细胞充分贴壁后，弃去旧培养基，每孔轻轻加入160μl含5％fbs的新鲜dmem培养基，按组别加入20μl 100.00、80.00、51.20、40.96的标准制剂(s0)和供试批次(s1～s
10
)参芪扶正注射液，对照组和5-fu模型组加入20μl生理盐水，置于酶标仪内震荡混匀，放回培养箱中培养。8小时后，5-fu模型组和参芪处理组都加入20μl 20μm的5-fu工作液，至终浓度为2μm；对照组(ct组)加入20μl 5％fbs的dmem培养基，置于酶标仪内震荡混匀，放回37℃,5％co2培养箱中继续孵育。16小时后，缓慢吸出培养基，沿侧壁加入100μl含10％cck-8的无血清dmem，培养箱中反应40～60分钟。酶标仪预温至37℃，震荡混匀30秒后，于450nm处测定吸光值(od)至ct组吸光度值(a)在0.7～0.9范围内。
[0134]
细胞活力计算：
[0135]
细胞活力(％)＝(a1–
a0)/(a2–
a0)
×
100％
[0136]
a1为参芪处理组的吸光度值；
[0137]
a2为fu模型组的吸光度值；
[0138]
a0为仅含有cck-8溶液的空白对照组；
[0139]
根据《中国药典2020版》，1431生物检测统计法，以“量反应平行线法”对实验结果进行平行性检验和效价计算，规定s0(批号：201108)的效价为100u/μl，待测制剂对5-fu抑制巨噬细胞的保护活性的效价不得低于70u/μl，平均可信限率《25％。
[0140]
实施例说明，本发明提供的参芪扶正注射液的生物学质控方法可有效、快速地评价参芪扶正注射液对化疗后巨噬细胞的保护作用。根据多批次样品的测定结果，93.77～104.61u/μl，rsd为10.88％。对多批次效价测定结果分别采用四分位数法，3倍标准差法进
行分析，拟定参芪扶正注射液的生物效价不低于70.00u/μl。
[0141]
综上所述，本发明克服了参芪扶正注射液单纯用化学质控的评价方法，本发明的生物效价评价方法与传统化学质控相结合，有助于提高产品的质量可控性，保障产品的临床疗效。
[0142]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0143]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
技术特征：1.一种raw264.7细胞的5-fu损伤模型的构建方法，包括以下步骤：配制raw264.7细胞悬浮液和5-fu工作液：将raw264.7细胞悬浮液接种至培养容器中，培养；加入5-fu工作液，继续培养，制得5-fu损伤模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述培养容器是细胞孔板，所述5-fu损伤模型的铺板密度为10000个/孔；和/或所述5-fu损伤模型的5-fu造模浓度为2μm；和/或所述5-fu损伤模型的造模时间为16h。3.权利要求1或2所述构建方法所得到的raw264.7细胞的5-fu损伤模型。4.权利要求3所述的raw264.7细胞的5-fu损伤模型在参芪制剂的质量评控中的应用。5.一种参芪制剂的质量评控方法，其特征在于，包括以下步骤:用参芪制剂配制成参芪溶液；配制5-fu工作液；获取raw264.7细胞悬浮液；将所述raw264.7细胞悬浮液接种至培养容器中，培养，将所述培养容器分为参芪处理组、5-fu模型组和对照组；向所述参芪处理组中添加所述参芪溶液，向所述5-fu模型组中添加等量的生理盐水，向所述对照组添加等量的生理盐水，培养；向所述参芪处理组添加所述5-fu工作液，向所述5-fu模型组添加等量的5-fu工作液，向所述对照组添加等量的细胞培养基，培养；细胞培养结束后，以所述对照组为基准，计算所述参芪处理组和所述5-fu模型组的细胞存活率。6.根据权利要求5所述的质量评控方法，其特征在于，将所述raw264.7细胞悬浮液接种至培养容器中的步骤中，所述培养容器是细胞孔板，铺板密度为10000个/孔；和/或向所述参芪处理组中添加所述参芪溶液，向所述5-fu模型组中添加等量的生理盐水，向所述对照组添加等量的生理盐水，培养的步骤中，培养时间为7-9h；和/或向所述参芪处理组添加所述5-fu工作液，向所述5-fu模型组添加等量的5-fu工作液，向所述对照组添加等量的细胞培养基，培养的步骤中，培养时间为4-16h；和/或所述参芪处理组和所述5-fu模型组中的所述5-fu工作液的最终浓度为2μm。7.根据权利要求5所述的质量评控方法，其特征在于，采用以下方法获取所述raw264.7细胞悬浮液：将保藏的raw264.7细胞复苏；将复苏的raw264.7细胞置于细胞培养基中进行培养；将细胞吹打，离心，弃去上清液，转移至新鲜细胞培养基中，培养；细胞80-90％融合时，弃去原细胞培养基，加入新鲜细胞培养基，刮下细胞、吹打均匀后，按1:4～1:6传代，继续培养；将细胞浓度调整为所需浓度，获得所述raw264.7细胞悬浮液。8.根据权利要求5所述的质量评控方法，其特征在于，细胞培养结束后，吸出各组的细胞培养基，并加入cck-8的无血清细胞培养基，在培养箱中反应40～60min，然后于450nm处，
使所述对照组的吸光度值在0.7～0.9范围内，测定各组的吸光度值，根据以下公式计算所述参芪处理组的细胞活力；细胞活力(％)＝(a1–
a0)/(a2–
a0)
×
100％其中，a1为所述参芪处理组的吸光度值，a2为所述fu模型组的吸光度值，a0为仅含有cck-8溶液的空白对照组的吸光度值。9.根据权利要求5-8任一项所述的质量评控方法，其特征在于，所述参芪处理组包括标准参芪处理组和供试参芪处理组；所述质量评控的方法还包括根据所述标准参芪处理组的细胞存活率，判断所述供试参芪处理组是否符合质量标准的步骤；和/或所述质量评控的方法还包括采用z-vad-fmk作为阳性参照检测质量评控方法的生物效价的步骤。10.根据权利要求5-8任一项所述的质量评控方法，其特征在于，所述参芪制剂为参芪扶正注射液。
技术总结本发明涉及5-Fu损伤模型的构建方法及其应用、参芪制剂的质量评控方法。本发明建立了单核巨噬细胞RAW264.7细胞的5-Fu损伤模型，模拟化疗药物对白细胞的细胞毒性作用，通过测定参芪制剂对模型中RAW264.7细胞的保护作用，来评价参芪制剂的生物活性，建立一种结合临床功效和体外细胞模型的生物质量评控方法。效和体外细胞模型的生物质量评控方法。效和体外细胞模型的生物质量评控方法。
技术研发人员：吴婉莹 张子佳 雷敏 邓燕萍 侯晋军 龙华丽 刘亮锋
受保护的技术使用者：丽珠集团利民制药厂
技术研发日：2021.06.09
技术公布日：2022/12/8
