本发明属于农业新品种选育技术领域，具体涉及一种利用玉米种子顶土力和种子顶土势能评价玉米耐深播性的方法，及利用种子顶土力和种子顶土势能预测不同播深下玉米基因型耐深播表型的方法。
背景技术：
玉米（zeamays）是我国重要的粮食、饲料及生物质能源作物之一，在保障我国粮食生产安全，促进畜牧业和工业持续健康发展等方面发挥着举足轻重的作用。然而我国三分之二的玉米种植面积分布于东北、西北、西南的干旱及半干旱区，在玉米播种期这些旱作玉米农业区常年土壤0~20cm土层蒸发量大，而含水量和降水量低，因墒情不足而严重影响了这些区域玉米安全播种及种子正常出苗生长，因此严重制约玉米的增产、稳产。
种子深播是玉米苗期避旱、保墒及保苗的重要途径之一。耐深播玉米因其可充分利用土壤深层水分、促进种子及时萌发出苗、且具有更强的顶土能力和破土出苗能力，因此，在玉米旱作农业区筛选优良耐深播基因资源、并用其培育耐深播、高产玉米优良新品种，同时及时赶墒深播，是一项拓宽玉米耐深播抗旱育种的新策略和节本高效的精简栽培措施，而准确、快速地筛选及评价耐深播优良基因资源成为耐深播、抗旱玉米育种及生产应用中最为重要的一环。目前，国内外学者都普遍借助各种栽培基质（大田耕土、沙土、蛭石等）在多种播种深度（一般播深为3、10、12.5、15、20及30cm）下萌发一定天数（常见为10d）后，测定玉米耐深播紧密关联的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、苗长、根长、根数、幼苗鲜重、根系鲜重、中胚轴粗、胚芽鞘粗、中胚轴与胚芽鞘中iaa（indolent-3-aceticacid）和ga（gibberellin）等来综合评价。
上述方面存在如下技术问题：（1）试验需浪费大量种子资源，（2）试验工作量大费时费力，（3）试验条件不好控制，误差较大等诸多弊端，（4）考虑指标过多，评价体系繁琐，因此给玉米耐深播优良基因资源的筛选及评价带来许多困难。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于提出与玉米种子顶土出苗紧密相关的种子顶土力和种子顶土势能的生物学概念，通过快速测定玉米种子顶土出苗时中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能，利用其综合评价玉米耐深播性的方法及快速预测不同播深下玉米基因型的耐深播表型的方法。本方法不受外界环境的影响，操作简便，节约种子资源，能快速、高效地评价出优良耐深播玉米基因资源及精准预测不同播深下玉米基因型的耐深播表型，进而服务于玉米耐深播抗旱新品种选育中。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
1.一种评价玉米耐深播性的方法，具体包括为：
（1）种子收集：收集不同玉米基因型种子；
（2）种子精选及消毒：精选籽粒饱满、均匀一致、无破损的玉米种子，先用体积百分比为0.5%的naclo溶液消毒种子10min后用ddh2o水冲洗种子3次，并用灭菌滤纸吸干附着水；
（3）浸种：室内常温下将消毒后的种子浸于ddh2o水中浸种24h；
（4）种子深播试验：播种前先往种子深播试验装置（高50cm，内径17cm）中分层装入灭菌蛭石，然后将浸种后的种子30粒均匀播种于灭菌蛭石上，再分别盖3、15和20cm灭菌蛭石使此种子深播试验装置装满，然后将其放置于智能人工气候室（每天光照12h，光照强度600μmol/(s.m2)，恒温22±0.5℃）培养，每隔3d补ddh2o水30ml。每一播深处理5次重复，播前统一配土、装钵。每一处理萌发10d后统计出苗率，再选取长势整体一致的幼苗5株，用ddh2o水快速洗掉幼苗根部的蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，测定相应的中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长、根长，并在上述幼苗中剪取中胚轴和胚芽鞘上部2~3cm样品，用智能种子顶土力精准测试系统测定相应的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能；
（5）种子培养皿萌发试验：先将双层灭菌滤纸设于灭菌培养皿（直径12cm）底部，再将浸种后的种子20粒均匀置于灭菌培养皿中并在种子表面盖双层灭菌滤纸，往灭菌培养皿中加入40ml的ddh2o水，然后将灭菌培养皿置于光照培养箱中恒温22±0.5℃暗培养，每隔2d补ddh2o水20ml，试验设5次重复。萌发10d后选取长势整体一致的幼苗5株，用灭菌滤纸吸干附着水，剪取中胚轴和胚芽鞘上部2~3cm样品，用智能种子顶土力精准测试系统测定相应的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能。
2.玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和顶土势能在评价玉米种子耐深播性中的应用。
有益效果：本发明创新提出采用种子培养皿萌发试验，具体以培养皿暗培养萌发10d后的玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状作为玉米耐深播评价指标，并借助隶属函数法，快速、精准、客观、科学、综合地评价玉米基因型资源的耐深播性强弱，还可利用这4个性状建立的多元逐步线性回归方程，快速预测相应玉米基因型资源在不同播深下的玉米耐深播表型表现。此方法能有效解决目前玉米耐深播基因型资源鉴定评价过程中遇到的上述诸多困难，试验条件精准可控，操作简便、节约种子资源、能够精准、快速、智能评价玉米基因型资源的耐深播性强弱，将在玉米耐深播抗旱育种中应用潜力巨大。
附图说明
图1是用于种子顶土力及种子顶土势能测试的gf-190901型—智能种子顶土力精准测试系统；
图2是gf-190901型—智能种子顶土力精准测试系统的种子顶土力和种子顶土势能测试结果及示意图；
图3是玉米耐深播性状隶属值（u）计算公式；
图4是不同（3、15和20cm）播深处理下玉米6个耐深播表型性状的方差分析（f-值）；
其中，相应性状间标***为p<0.001水平差异显著。rat:出苗率,mes:中胚轴长,col:胚芽鞘长,mes col:中胚轴与胚芽鞘之和,sdl:苗长,rl:根长。下同。
图5是不同（3、15和20cm）播深处理下13份玉米基因型的6个耐深播表型性状统计分析；
图6是不同处理下玉米6个耐深播表型、中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能间的变异系数雷达图；
图7是不同（3、15和20cm）播深及培养皿暗培养处理下玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能的方差分析（f-值）；
其中，相应性状间标***为p<0.001水平差异显著。f(mes):中胚轴种子顶土力,f(col):胚芽鞘种子顶土力,pe(mes):中胚轴种子顶土势能,pe(col):胚芽鞘种子顶土势能。下同。
图8是3种播深处理下的平均中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能与培养皿暗培养处理下的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能t—检验分析；
图9是培养皿暗培养10d后个别玉米基因型（ji853）的生长状况；
图10是培养皿暗培养10d后13份玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能统计分析；
其中，不同大写字母表示同一性状在不同玉米基因型间在p<0.01水平下差异显著。
图11是玉米6个耐深播表型、中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能及播深间的相关分析；
其中，（粗/细）黑色虚线表示两个性状彼此在p<0.01/p<0.05水平下显著正相关，（粗/细）灰色虚线表示两个性状彼此在p<0.01/p<0.05水平下显著负相关。
图12是综合3种播深（3、15和20cm）根据6个耐深播表型性状对13份玉米基因型的系统聚类分析；
图13是综合3种播深（3、15和20cm）根据6个耐深播表型性状和培养皿暗培养下根据中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能对13份玉米基因型的系统聚类分析；
图14是培养皿暗培养下根据中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能对13份玉米基因型的系统聚类分析；
图15是培养皿暗培养下采用中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能的隶属值（u）综合评价13份玉米基因型的耐深播性；
图16是根据培养皿暗培养下中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能预测3cm播深下的玉米基因型6个耐深播表型的多元逐步线性回归方程；
其中，y1:3cm播深下的出苗率,y2:3cm播深下的中胚轴长y3:3cm播深下的胚芽鞘长,y4:3cm播深下的中胚轴与胚芽鞘之和,y5:3cm播深下的苗长,y6:3cm播深下的根长,x1:培养皿暗培养下的中胚轴种子顶土力,x2:培养皿暗培养下的胚芽鞘种子顶土力,x3:培养皿暗培养下的中胚轴种子顶土势能,x4:培养皿暗培养下的胚芽鞘种子顶土势能。
图17是根据培养皿暗培养下中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能预测15cm播深下的玉米基因型6个耐深播表型的多元逐步线性回归方程；
其中，y1:15cm播深下的出苗率,y2:15cm播深下的中胚轴长y3:15cm播深下的胚芽鞘长,y4:15cm播深下的中胚轴与胚芽鞘之和,y5:15cm播深下的苗长,y6:15cm播深下的根长,x1:培养皿暗培养下的中胚轴种子顶土力,x2:培养皿暗培养下的胚芽鞘种子顶土力,x3:培养皿暗培养下的中胚轴种子顶土势能,x4:培养皿暗培养下的胚芽鞘种子顶土势能。
图18是根据培养皿暗培养下中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能预测20cm播深下的玉米基因型6个耐深播表型的多元逐步线性回归方程；
其中，y1:20cm播深下的出苗率,y2:20cm播深下的中胚轴长y3:20cm播深下的胚芽鞘长,y4:20cm播深下的中胚轴与胚芽鞘之和,y5:20cm播深下的苗长,y6:20cm播深下的根长,x1:培养皿暗培养下的中胚轴种子顶土力,x2:培养皿暗培养下的胚芽鞘种子顶土力,x3:培养皿暗培养下的中胚轴种子顶土势能,x4:培养皿暗培养下的胚芽鞘种子顶土势能。
图19是本发明一种智能种子顶土力测试系统的整体示意图；
图20是本发明一种智能种子顶土力测试系统的测试器内部构造整体示意图；
图21是本发明一种智能种子顶土力测试系统的测试器内部样品固定及直线运动模块构造局部示意图；
图22是本发明一种智能种子顶土力测试系统的测试器内部顶土力测试模块构造局部示意图；
图23是本发明一种智能种子顶土力测试系统的显示屏内部顶土力数据采集分析电路图；
图24是本发明智能种子顶土力精准测试系统相关技术参数；
图19-24中，测试器底座1、外壳2、连杆3、手柄4、摇杆5、摇杆孔6、进样窗7、数据线8、显示屏9、螺栓10、支架11、显示屏底座12、电源线13、滚珠丝杠14、小螺母套15、卡簧16、深沟球轴承17、大螺母套18、轴承座19、锁紧螺钉20、样品夹头21、连接件22、滑块23、传感器安装架24、挡板25、承压板26、压力传感器27、直线导轨28、样品夹孔29、回位弹簧30。
具体实施方法
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供一种玉米中胚轴/胚芽鞘顶土力和种子顶土势能在评价玉米耐深播性中的应用，该应用的确定方法如下：
1.材料收集：收集耐深播性差异较大的ts141、ji853、n192、w64a、8723、ts163、k12、b73、qi319、a154、ye488、luyuan92和p138等13份玉米基因型资源种子。这13份玉米基因型种子均由甘肃省干旱生境作物学重点实验室—分子标记辅助选育实验室提供。
2.种子精选及消毒：精选籽粒饱满、均匀一致、无破损的13份玉米基因型种子，先用体积百分比为0.5%的naclo溶液消毒种子10min后用ddh2o水冲洗种子3次，并用灭菌滤纸吸干附着水，备用。
3.浸种：室内常温下将消毒的13份玉米基因型种子用ddh2o水浸种24h。备用。
4.种子深播试验：播种前先往种子深播试验装置（授权公告号：cn209768182u，高50cm，内径17cm）中分层装入灭菌蛭石，然后将浸种后的13份玉米基因型种子各30粒均匀播种于灭菌蛭石上，再分别盖3、15和20cm灭菌蛭石使此种子深播试验装置装满，然后将其放置于智能人工气候室（每天光照12h，光照强度600μmol/(s.m2)，恒温22±0.5℃）培养，每隔3d补ddh2o水30ml。每一播深处理5次重复，播前统一配土、装钵。每一处理萌发10d后统计出苗率（seedlingemergencerate,rat），再选取长势整体一致的幼苗5株，用ddh2o水快速洗掉幼苗根部的蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，测定相应玉米基因型的中胚轴长（mesocotyllength,mes）、胚芽鞘长（coleoptilelength,col）、中胚轴与胚芽鞘之和（mesocotylandcoleoptilelength,mes col）、苗长（seedlinglength,sdl）、根长（rootlength,rl），并在上述幼苗中剪取中胚轴和胚芽鞘上部2~3cm样品，用gf-190901型智能种子顶土力精准测试系统（附图1和实施例4）测定相应玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力（forceofdeep-sowinginmesocotyl/coleoptile,f(mes)/f(col)）和中胚轴/胚芽鞘种子顶土势能（potentialenergyofdeep-sowinginmesocotyl/coleoptile,pe(mes)/pe(col)）。
5.种子培养皿萌发试验：先将双层灭菌滤纸设于灭菌培养皿（直径12cm）底部，再将浸种后的13份玉米基因型种子各20粒均匀置于灭菌培养皿中并在种子表面盖双层灭菌滤纸，往灭菌培养皿中加入40ml的ddh2o，然后将灭菌培养皿置于spx-300b-g型光照培养箱中恒温22±0.5℃暗培养，每隔2d补ddh2o水20ml，试验设3次重复。萌发10d后选取长势整体一致的幼苗5株，用灭菌滤纸吸干附着水，剪取中胚轴和胚芽鞘上部2~3cm样品，用gf-190901型智能种子顶土力精准测试系统（附图1和实施例4）测定相应玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力、中胚轴/胚芽鞘种子顶土势能。
6.中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能生物学概念：为了客观评价种子顶土出苗的能力，本发明利用不同处理下生长到一定大小的种子样品（中胚轴/胚芽鞘），新定义了中胚轴/胚芽鞘种子顶土力（f(mes)/f(col)）和种子顶土势能（pe(mes)/pe(col)）的生物学概念。f(mes)/f(col)是指种子玉米种子样品（中胚轴/胚芽鞘）生长到一定长度时的种子样品最大塑性形变产生的力，其反映种子顶土出苗时对土壤的最大作用力，单位为牛顿（n）（附图2）。pe(mes)/pe(col)是指种子样品（中胚轴/胚芽鞘）生长到一定长度时的种子样品最大塑性形变位移（displacement,s）与该种子样品的种子顶土力f(mes)/f(col)所构成的面积表示，其反映种子顶土出苗潜在的最大顶土能量，单位为焦耳（j）（附图2）。
7.耐深播性综合隶属值：采用隶属函数法，通过计算不同处理下不同耐深播性状的耐深播隶属值（membershipvalue,u）对13份玉米基因型的耐深播性综合评价，其公式为附图3公式（1）和（2）。式中：
8.结果分析：所有试验数据均采用microsoftexcel2016软件对数据进行统计绘图，采用ibmspss19.0软件对数据进行t—检验分析、duncan多重比较方差分析、pearson相关分析、组间系统聚类分析及逐步线性回归分析。
实施例2
本实施例提供实施例1所述方法的比较结果，具体如下：
1.不同深播处理下玉米耐深播表型的差异分析：在3种播深处理（3、15和20cm）下对耐深播性差异较大的13份玉米基因型6个耐深播表型性状进行方差分析表明，如附图4（表1）所示，这6个耐深播表型的校正模型均达到了p<0.001水平差异显著。说明，方差分析中这6个耐深播表型的整体方差均显著。因此，可对这6个耐深播表型进行基因型间、播深间、基因型×播深互作间进行方差分析是有效的。进一步分析显示，出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长均在基因型间、播深间、基因型×播深互作间达到p<0.001显著水平。说明，玉米的这6个耐深播表型均显著受玉米基因型本身遗传特性、播种深度及其互作效应的共同影响，但其对玉米基因型这些耐深播表型的影响程度不同，其对玉米6个耐深播表型的影响程度依次均为播深间>基因型间>基因型×播深互作间，其f-值依次降低。说明，播深对玉米基因型的这6个耐深播表型的影响程度最大，不同玉米基因型的这些耐深播表型随播种深度的增加其变化最大。
2.不同玉米基因型耐深播表型随播深的变化：如附图5所示，整体而言，随播深从3cm增加到15/20cm，13份玉米基因型的出苗率和苗长均显著降低，其分别降低了36.36%/70.11%和35.66%/43.76%，中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和均显著伸长，其分别升高了110.20%/150.80%、45.30%/76.90%和76.18%/113.36%。在15cm播深下，13份玉米基因型的根长呈伸长趋势，其伸长了3.48%，而在20cm播深下，这些玉米基因型的根长呈缩短趋势，其缩短了23.43%。此外，如附图6显示，3种播深处理下，13份玉米基因型的这6个耐深播表型的变异系数依次为中胚轴长（45.65%）>根长（35.40%）>出苗率（32.47%）>中胚轴与胚芽鞘之和（26.40%）>苗长（17.06%）>16.48%。说明，中胚轴的长短对玉米基因型差异的影响最大。
3.不同播深及培养皿暗培养处理下玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能的差异分析：联合3种播深（3、15和20cm）和培养皿暗培养处理下对耐深播性差异较大的13份玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能进行方差分析表明，如附图7（表2）所示，中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状的校正模型均达到了p<0.001水平差异显著。说明，方差分析中玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能的整体方差均显著，因此可对这4个性状进行基因型间、处理间、基因型×处理互作间进行方差分析是有效的。进一步分析显示，中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能均只在基因型间达到p<0.001显著水平，而在处理间、基因型×处理互作间均不显著（p>0.05。）说明，玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能是玉米自身固有的遗传特性，只受玉米基因型自身遗传基础的稳定遗传。
4.不同播深及培养皿暗培养处理下玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能t—检验分析：整合3种播深（3、15和20cm）下13份玉米基因型的平均中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能与培养皿暗培养10d后测定的13份玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能进行了t—检验分析，如附图8（表3）所示，这13份玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能均不受播深处理及培养皿暗培养的影响（p>0.05）。说明，玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能是玉米自身固有的遗传特性，不受环境效应的影响。因此，可用培养皿暗培养的方法快速测试玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能。
5.不同玉米基因型中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能差异分析：通过培养皿暗培养10d后（附图9）对耐深播性差异较大的13份玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能进行方差分析，如附图10显示，这13份玉米基因型在其中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能间差异显著（p<0.01）。其中这13份玉米基因型中胚轴种子顶土力介于0.059n（a154）~1.419n（ye488），胚芽鞘种子顶土力介于0.021n（a154）~4.080n（n192），中胚轴种子顶土势能介于0.002j（ji853）~0.069j（w64a），胚芽鞘种子顶土势能介于0.003j（ji853）~0.114j（n192）。进一步分析还表明（附图5和10），中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能大的玉米基因型如n192和w64a，其在3种播深下也具有较高的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长和根长。此外，如附图6显示，这13份玉米基因型中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能的变异系数依次为胚芽鞘种子顶土力（135.70%）>中胚轴种子顶土力（100.47%）>胚芽鞘种子顶土势能（95.83%）>中胚轴种子顶土势能（90.25%），其均明显高于6个耐深播表型的变异系数。
6.玉米耐深播表型、中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能及播深间的相关分析：整合13份玉米基因型在3种播深下的6个耐深播表型、培养皿暗培养10d后测定的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能及播深间进行了pearson相关分析，如附图11所示，玉米的这6个耐深播表型与播深间及6个耐深播表型彼此间均在p<0.01/p<0.05水平显著正/负相关。说明，玉米的这6个耐深播表型显著受播深的影响，且6个耐深播表型间相互关联，彼此间通过协同或抑制作用共同决定玉米基因型的耐深播特性。此外，玉米的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能均与6个耐深播表型间均在p<0.01/p<0.05水平显著正/负相关。说明，中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能均与玉米的6个耐深播表型一样，其与玉米的耐深播性紧密关联，因此，可用中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能来客观评价玉米的耐深播性强弱及预测玉米耐深播表型的大小。
7.玉米耐深播性系统聚类评价：采用与玉米耐深播性紧密关联的不同性状对耐深播性差异较大的13份玉米基因型进行了耐深播性系统聚类评价。如附图12所示，单独整合3种播深（3、15和20cm）下根据平均出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长等6个耐深播表型，在欧式距离为3时，将13份玉米基因型划分为4种耐深播基因型类型，其中a为强耐深播基因型，包括w64a和n192，b为中等耐深播基因型，包括b73、luyuan92和ye488，c由c-1和c-2两种亚型组成，为弱耐深播基因型，包括ts163、8723和ji853，d为深播敏感基因型，包括k12、p138、ts141、a154和qi319。如附图13所示，整合3种播深（3、15和20cm）下根据平均出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长等耐深播表型及培养皿暗培养下根据中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等，在欧式距离为10.5时，将13份玉米基因型划分为3种耐深播基因型类型，其中a为强耐深播基因型，包括w64a、n192和ye488，bc型又细分为bc-b（中等耐深播基因型，包括b73、luyuan92和ts163）和bc-c型（弱耐深播基因型，包括8723和ji853），d为深播敏感基因型，包括qi319、p138、ts141、k12和a154。如附图14所示，单独培养皿暗培养下根据中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等，在欧式距离为3时，将13份玉米基因型划分为4种耐深播基因型类型，a为强耐深播基因型，包括w64a和n192，b为中等耐深播基因型，包括b73、luyuan92和ye488，c由c-1和c-2两种亚型组成，为弱耐深播基因型，包括ts163、ji853和8723，d为深播敏感基因型，包括k12、p138、ts141、a154和qi319。综合上述3耐深播性系统聚类评价结果可知，上述3种方法的结果均高度一致，特别是单独整合3种播深（3、15和20cm）下根据平均6个耐深播表型等系统聚类结果与单独培养皿暗培养下根据中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等系统聚类结果完全一致。因此，完全可在单独培养皿暗培养下根据中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能对不同玉米基因型的耐深播性进行综合客观评价。但是利用此方法系统聚类结果只能定性模糊地将不同玉米基因型的耐深播性强弱定性划分，却不能客观定量揭示不同玉米基因型的耐深播性强弱。
8.玉米耐深播性隶属值综合评价：基于以上考虑，我们以培养皿暗培养10d后13份玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能作为不同玉米基因型耐深播性综合评价指标，采用隶属函数法，通过计算中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能的隶属值，定量、科学、客观、综合地评价13份玉米基因型的耐深播性。如附图15所示，a154/ye488的中胚轴种子顶土力的隶属值最小/大，a154和n192的胚芽鞘种子顶土力的隶属值最小/大，ji853/w64a的中胚轴种子顶土势能的隶属值最小/大，ji853/n192的胚芽鞘种子顶土势能的隶属值最小/大。并结合4个性状的隶属值换算出每一玉米基因型的算术耐深播隶属值u后显示，这13份玉米基因型的耐深播隶属值u介于0.022（ts141）~0.954（n192）。说明ts141的耐深播性最小，而n192的耐深播性最强。进一步结合上述13份玉米基因型系统聚类结果（附图14），根据耐深播隶属值u，将13份玉米基因型的耐深播划分为4级，即u≤0.250时为深播敏感基因型；0.251≤u≤0.500时为弱耐深播基因型；0.501≤u≤0.750时为中等耐深播基因型；u≥0.751时为强耐深播基因型。根据此评价方法得出n192和w64a均为强耐深播基因型，其u分别为0.954和0.799；ye488为中等耐深播基因型，其u为0.643；8723、b73、a154和luyuan92等为弱耐深播基因型，其u分别为0.468、0.282、0.266和0.377；其他6份玉米基因型为深播敏感基因型，其u介于0.022~0.168。这与上述利用这4个性状系统聚类结果相一致（附图14）。说明利用隶属函数法能够定量、科学、客观、综合地评价不同玉米基因型的耐深播性强弱。
9.不同玉米基因型耐深播表型的预测：上述pearson相关分析表明，不同玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能均与6个耐深播表型间均在p<0.01/p<0.05水平显著正/负相关（附图11）。因此，可采用培养皿暗培养下的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状分别为自变量（x1~x4），以3种播深（3、15和20cm）下的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长和根长等6个耐深播表型分别为因变量（y1~y6），建立多元逐步线性回归方程。如附图16（表5）公式（3）~（8）为根据培养皿暗培养下中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能预测3cm播深下的玉米基因型6个耐深播表型的6个多元逐步线性回归方程；如附图17（表6）公式（9）~（14）为根据培养皿暗培养下中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能预测15cm播深下的玉米基因型6个耐深播表型的6个多元逐步线性回归方程；如附图18（表7）公式（15）~（20）为根据培养皿暗培养下中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能预测20cm播深下的玉米基因型6个耐深播表型的6个多元逐步线性回归方程。上述方程中自变量xi系数为偏回归系数，它表示xi每增加一个单位时，因变量yi的增加量。对上述所有多元逐步线性回归方程的f—检验结果表明表明，相应所有回归方程均达到p<0.001显著水平。因此，借助这些回归方程，用培养皿暗培养下的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状客观地预测3种播深下相应玉米基因型的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长和根长等6个耐深播表型。
从上述实例可以看出，新定义的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等不仅只受玉米基因型自身固有遗传特性的调控，而且这4个性状与6个玉米耐深播表型间均在p<0.01/p<0.05水平显著正/负相关，同时与6个玉米耐深播表型相比，这4个性状不受环境效应的影响，在不同玉米基因型间的变异系数明显高于6个玉米耐深播表型，同时用培养皿暗培养下的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能对不同玉米基因型的耐深播系统聚类结果与整合3种播深下根据6个耐深播表型耐深播系统聚类结果完全相一致，进一步采用隶属函数法，通过计算中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能的隶属值，定量、科学、客观、综合地评价了不同玉米基因型的耐深播性强弱和种子深播顶土出苗性能，还通过用培养皿暗培养下的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等客观地预测3种播深下相应玉米基因型的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长和根长等耐深播表型。因此，此方法不仅可快速、高效、准确、客观地评价不同玉米基因型的耐深播性强弱和种子深播顶土出苗性能，同时还能直观、准确地预测不同玉米基因型在不同播深下的相应耐深播表型，可为玉米耐深播优良基因型资源的筛选及育种应用提供技术支撑，具有很高的应用价值。
实施例3
本发明提供一种评价玉米耐深播性的方法，具体方法为：
1.材料收集：收集不同玉米基因型种子。
2.种子精选及消毒：精选籽粒饱满、均匀一致、无破损的玉米基因型种子，先用体积百分比为0.5%的naclo溶液消毒种子10min后用ddh2o水冲洗种子3次，并用灭菌滤纸吸干附着水。
3.浸种：室内常温下将消毒的玉米基因型种子用ddh2o水浸种24h。
4.种子培养皿萌发试验：先将双层灭菌滤纸设于灭菌培养皿（直径12cm）底部，再将浸种后的玉米基因型种子各20粒均匀置于灭菌培养皿中并在种子表面盖双层灭菌滤纸，往灭菌培养皿中加入40ml的ddh2o，然后将灭菌培养皿置于光照培养箱中恒温22±0.5℃暗培养10d，每隔2d补ddh2o水20ml，试验设3次重复。萌发10d后选取长势整体一致的幼苗5株，用灭菌滤纸吸干附着水，剪取中胚轴和胚芽鞘上部2~3cm样品，用gf-190901型智能种子顶土力精准测试系统测定相应玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状。
5.玉米基因型耐深播性综合评价：采用隶属函数法，按照附图3公式（1）和（2）计算相应玉米基因型中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状隶属值，并以这4个性状隶属值的算术平均数作为相应玉米基因型的耐深播性隶属值，值越大则玉米基因型的耐深播性越强。根据耐深播隶属值u，将玉米基因型的耐深播划分为4级，即u≤0.250时为深播敏感基因型；0.251≤u≤0.500时为弱耐深播基因型；0.501≤u≤0.750时为中等耐深播基因型；u≥0.751时为强耐深播基因型。
6.玉米基因型耐深播表型预测：根据培养皿暗培养下中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状，按照附图16（表5）公式（3）~（8）分别预测3cm播深下玉米基因型的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长和根长6个耐深播表型；按照附图17（表6）公式（9）~（14）分别预测15cm播深下玉米基因型的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长和根长6个耐深播表型；按照附图18（表7）公式（15）~（20）分别预测20cm播深下玉米基因型的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长和根长6个耐深播表型。
实施例4
本实施例提供了一种智能种子顶土力测试系统，如附图19-24，其结构包括：显示屏底座12上方设置支架11，支架11另一端通过螺栓10与显示屏9相连，显示屏9的一侧连有电源线13，测试器底座1与外壳2通过卡扣固定，测试器底座1上方从左到右依次与传感器安装架24、直线导轨28、轴承座19通过螺母固定，外壳2上方设有进样窗7，传感器安装架24的两侧对称连接挡板25，传感器安装架24的中间连接压力传感器27，压力传感器27通过数据线8与显示屏9的另一侧相连，压力传感器27一侧与承压板26相连，滑块23嵌套在直线导轨28的外侧，滑块23上方与样品夹头21通过连接件22相连，样品夹头21上方嵌套锁紧螺钉20，锁紧螺钉20一侧与回位弹簧30相连，样品夹头21与承压板26的对立两侧对称设有样品夹孔29，样品夹头21另一侧与滚珠丝杠14相连，滚珠丝杠14外面套有大螺母套18，大螺母套18两侧通过卡簧16分别与深沟球轴承17相连，一侧的深沟球轴承17还与轴承座19相连，另一侧的深沟球轴承17还与摇杆5一侧相连，摇杆5另一侧依次穿过小螺母套15和摇杆孔6并与连杆3及手柄4相连，小螺母套15一侧固定在大螺母套18的一侧。
进一步地，支架11通过螺栓10与显示屏9连接，能够拆卸，支架11的数量设为2个；
进一步地，显示屏9采用anmite触控led显示屏，便于方便操作（附图24（表8）），且压力传感器27探测到的数据通过显示屏9内部的顶土力数据采集分析电路图（附图23）进行数据采集分析，并通过显示屏9显示出来；
进一步地，测试器底座1和外壳2采用不锈钢材料，测试器底座1与外壳2通过卡扣固定，能够拆卸；
进一步地，压力传感器27的两侧对称设有2个挡板25，以保护压力传感器27因受力过大而对其造成的不可恢复的机械损伤；
进一步地，压力传感器27采用德国hbm公司的pw4mc3/300g压力传感器（附图24（表8）），压力传感器27的一侧与承压板26连接，以保护压力传感器27不受损坏或腐蚀；
进一步地，样品夹头21上方嵌套锁紧螺钉20，锁紧螺钉20一侧与回位弹簧30相连，回位弹簧30采用gutekunst弹簧（附图24（表8）），旋转锁紧螺钉20后回位弹簧30产生相反的作用力，进而确定样品夹头21上的样品夹孔29大小，以便固定好样品不至于损坏样品;
进一步地，样品夹头21上的样品夹孔29对称位置，在承压板26上也设置1个样品夹孔30，用于固定样品；
进一步地，直线导轨28上涂有anti-scuffspray润滑剂，且直线导轨28外侧嵌套滑块23，以减少滑块23直线运动时产生的摩擦力；
进一步地，测试器底座1上方从左到右依次通过螺母与传感器安装架24、直线导轨28及轴承座19连接，方便拆卸；
进一步地，深沟球轴承17采用61907-z深沟球轴承（附图24（表8）），设置为2个，分别通过卡簧16与大螺母套18两侧连接，且一个深沟球轴承17另一侧与轴承座19连接，另一个深沟球轴承17另一侧与摇杆5连接；
进一步地，滚珠丝杠14采用r0mani-1604滚珠丝杠（附图24（表8）），且滚珠丝杠14套在大螺母套18上，滚珠丝杠14的一侧还与样品夹头21的一侧连接。
实施例5
本实施例提供了一种智能种子顶土力测试系统的测试方法，使用本发明进行测试时，先插电源线13，打开显示屏9电源，将显示屏9设置到测试界面，然后将待测种子样品（胚芽鞘或中胚轴）通过外壳2上方的进样窗7放入样品夹头21和承压板26两侧对称的样品夹孔29中，通过旋转样品夹头21上的紧锁螺钉20，使回位弹簧30产生相反的作用力进而固定好样品，且不损害样品；再通过手动缓慢旋转手柄4带动连杆3使摇杆5在小螺母套15上产生作用力，进而带动摇杆5一侧的深沟球轴承17及轴承座19上方的另一个深沟球轴承17同时旋转，深沟球轴承17分别通过卡簧16与大螺母套18两侧连接，使得大螺母套18内侧的滚珠丝杠14最终带动样品夹头21带动种子样品前后移动；此外，由于样品夹头21通过连接件22与滑块23连接，且滑块23嵌套在直线导轨28的外侧，因此，样品夹头21直线前后移动时作用于种子样品，使种子样品弯曲；待种子样品塑性形变的作用力被安装在传感器安装架24上的压力传感器27探测到（压力传感器27的上下两侧设有2个挡板25，压力传感器27的外侧与承压板27连接，以保护压力传感器27不受腐蚀及机械损伤），并通过数据线8将压力传感器27探测到的作用力传输到显示屏9上（显示屏9通过螺栓10与支架11一端连接，支架11的另一端与显示屏底座12连接）时，此时显示屏9上的读数即为相应种子样品的顶土力，进而完成了一个操作过程。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
1.一种评价玉米耐深播性的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）收集不同玉米基因型种子；（2）种子精选及消毒；（3）浸种；（4）种子深播试验；（5）种子培养皿萌发试验。
2.根据权利要求1所述的一种评价玉米耐深播性的方法，其特征在于，所述步骤（2）包括：精选籽粒饱满、均匀一致、无破损的玉米基因型种子，先用体积百分比为0.5%的naclo溶液消毒种子10min后用ddh2o水冲洗种子3次，并用灭菌滤纸吸干附着水。
3.根据权利要求1所述的一种评价玉米耐深播性的方法，其特征在于，所述步骤（3）包括：室内常温下将消毒的玉米基因型种子用ddh2o水浸种24h。
4.根据权利要求1所述的一种评价玉米耐深播性的方法，其特征在于，所述步骤（4）包括：播种前先往种子深播试验装置（高50cm，内径17cm）中分层装入灭菌蛭石，然后将浸种后的玉米基因型种子各30粒均匀播种于灭菌蛭石上，再分别盖3、15和20cm灭菌蛭石使此种子深播试验装置装满，然后将其放置于智能人工气候室（每天光照12h，光照强度600μmol/(s.m2)，恒温22±0.5℃）培养，每隔3d补ddh2o水30ml；每一播深处理5次重复，播前统一配土、装钵；每一处理萌发10d后统计出苗率，再选取长势整体一致的幼苗5株，用ddh2o水快速洗掉幼苗根部的蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，测定相应材料的中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长、根长，并在上述幼苗中剪取中胚轴和胚芽鞘上部2~3cm样品，用智能种子顶土力精准测试系统测定相应玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能。
5.根据权利要求1所述的一种评价玉米耐深播性的方法，其特征在于，所述步骤（5）包括：先将双层灭菌滤纸设于灭菌培养皿（直径12cm）底部，再将浸种后的玉米基因型种子各20粒均匀置于灭菌培养皿中并在种子表面盖双层灭菌滤纸，往灭菌培养皿中加入40ml的ddh2o水，然后将灭菌培养皿置于光照培养箱中恒温22±0.5℃暗培养，每隔2d补ddh2o水20ml，试验设3次重复；萌发10d后选取长势整体一致的幼苗5株，用灭菌滤纸吸干附着水，剪取中胚轴和胚芽鞘上部2~3cm样品，用智能种子顶土力精准测试系统测定相应玉米基因型的中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能。
6.一种玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能评价玉米耐深播性中的应用。
7.根据权利要求6所述一种玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能评价玉米耐深播性中的应用，其特征在于，该应用通过如下方法确定：（1）材料收集；（2）种子精选及消毒；（3）浸种；（4）种子培养皿萌发试验；（5）玉米耐深播性综合评价：（6）玉米耐深播表型预测。
8.根据权利要求7所述一种玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能评价玉米耐深播性中的应用，其特征在于，所述步骤（5）包括：采用隶属函数法，按照如下公式（1）和（2）计算相应玉米基因型中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状隶属值，并以这4个性状隶属值的算术平均数作为相应玉米基因型的耐深播性隶属值（u），值越大则玉米基因型的耐深播性越强；根据耐深播隶属值，将玉米基因型的耐深播划分为4级，即u≤0.250时为深播敏感基因型，0.251≤u≤0.500时为弱耐深播基因型，0.501≤u≤0.750时为中等耐深播基因型，u≥0.751时为强耐深播基因型；
公式（1）：uijk=(tijk-tikmin)/(tikmax-tikmin)；
公式（2）：ujk=1-tijk-tikmin)/(tikmax-tikmin)；
式中：uijk为第i处理（即种子培养皿萌发试验）下第j个基因型第k个性状的耐深播隶属值，tijk为第i处理下第j个基因型第k个性状的测定值，tikmax为第i处理下不同基因型间第k个性状的最大测量值，tikmin为第i处理下不同基因型间第k个性状的最小测量值；若所测性状与玉米的耐深播性呈正相关，则采用（1）式计算种子培养皿萌发试验下相应性状的耐深播隶属值，反之则采用（2）式；累计种子培养皿萌发试验下各性状的耐深播隶属值，并求其算术平均数进行比较，均值越大则玉米基因型的耐深播性越强。
9.根据权利要求7所述一种玉米中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能评价玉米耐深播性中的应用，其特征在于，所述步骤（6）包括：根据培养皿种子暗培养萌发下中胚轴/胚芽鞘种子顶土力和种子顶土势能等4个性状，按照16（表5）公式（3）~（8）分别预测3cm播深下玉米基因型的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长和根长等6个耐深播表型；按照17（表6）公式（9）~（14）分别预测15cm播深下玉米基因型的这6个耐深播表型；按照18（表7）公式（15）~（20）分别预测20cm播深下玉米基因型的这6个耐深播表型；
公式（3）：y1=94.679 2.558x1-1.178x2 87.667x3(r=0.623**,f=9.113**)；
公式（4）：y2=2.037-1.403x1 0.200x2 11.944x3 26.649x4(r=0.760***,f=15.833***)；
公式（5）：y3=3.132-1.369x1 0.046x2 4.908x3 14.354x4(r=0.639***,f=6.895***)；
公式（6）：y4=5.152-2.757x1 0.241x2 16.321x3 41.496x4(r=0.709***,f=10.136***)；
公式（7）：y5=14.959 4.796x1 1.528x2-7.180x3-74.282x4(r=0.726***,f=11.123***)；
公式（8）：y6=27.537 1.628x1 6.099x2-96.023x3-83.397x4(r=0.741***,f=12.191***)；
公式（9）：y1=44.252 2.114x1-7.006x2-703.944x3 1156.421x4(r=0.854***,f=27.052***)；
公式（10）：y2=4.155-0.392x1 0.157x2 5.101x3 62.467x4(r=0.866***,f=31.296***)；
公式（11）：y3=5.531-2.862x1 0.483x2 13.511x3-3.249x4(r=0.570***,f=15.232***)；
公式（12）：y4=9.686-3.253x1 0.640x2 18.611x3 59.218x4(r=0.731***,f=13.323***)；
公式（13）：y5=11.946-1.637x1 1.636x2(r=0.576*,f=3.229*)；
公式（14）：y6=22.445 0.459x1 1.426x2-256.607x3 187.431x4(r=0.654***,f=7.457***)；
公式(15)：y1=-2.756 3.824x1 2.874x2 246.446x3 746.103x4(r=0.968***,f=147.693***)；
公式（16）：y2=3.923-1.336x1-0.420x2 1.156x3 105.201x4(r=0.689***,f=38.760***)；
公式（17）：y3=5.019-0.180x1-0.515x2-33.505x3 29.866x4(r=0.689***,f=38.760***)；
公式（18）：y4=8.941-1.516x1-0.935x2-32.348x3 135.067x4(r=0.841***,f=24.200***)；
公式（19）：y5=10.351 0.106x1 1.278x2-62.598x3(r=0.443*,f=3.317*)；
公式（20）：y6=19.737-2.728x1 0.945x2-105.335x3 150.369x4(r=0.578**,f=5.021**)；
式中：y1:相应播深（3、15或20cm）下的出苗率,y2:相应播深（3、15或20cm）下的中胚轴长,y3:相应播深（3、15或20cm）下的胚芽鞘长,y4:相应播深（3、15或20cm）下的中胚轴与胚芽鞘之和,y5:相应播深（3、15或20cm）下的苗长,y6:相应播深（3、15或20cm）下的根长,x1:培养皿暗培养下的中胚轴种子顶土力,x2:培养皿暗培养下的胚芽鞘种子顶土力,x3:培养皿暗培养下的中胚轴种子顶土势能,x4:培养皿暗培养下的胚芽鞘种子顶土势能。
技术总结