本发明属于生物技术领域，具体涉及一种剥皮法在生产沉香中的应用。
背景技术：
沉香是沉香源植物受伤后历经多年沉积所得树脂状物质，其主要特征性成分为倍半萜类和2-(2-苯乙基)色酮类化合物，是植物体受到外界刺激所产生的次生代谢产物。全球沉香源植物包括至少26种沉香属aquilaria植物、8种拟沉香属gyrinops植物中的部分树种。沉香属26个树种已列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录加以保护。
沉香是珍稀名贵中药材，具有多种药用功能，药理学研究证明其化学成分具有多种疗效；沉香是名贵香料，香道文化源远流长，在日本和东南亚国家已发展出多样的形态；沉香与宗教密切相关，世界五大宗教均视沉香为难得的珍品；沉香工艺品是收藏的热门。
我国生产沉香的主要植物来源即白木香（土沉香）aquilariasinensis，主产于海南、广东、广西、福建、台湾、云南等省区。由于自然结香周期长，结香机率低，野生沉香资源日渐枯竭，沉香价格飙升，催生了人工种植及结香、加工、销售乃至金融业的产业链。有关统计表明，2000年以来关于沉香的研究逐渐活跃，沉香化学成分的研究是研究重点，有力促进了沉香产业的发展。人工结香技术和理论在十多年的研究中已经有所突破和进展，主要包括砍伤法、半断干、断枝法、凿洞法、打钉法、接菌法、化学伤害结香法等等。
由于结香技术仍不够成熟，沉香产业的发展受到极大的限制，大面积白木香人工林种植已近10年，但大部分种植户经济效益低迷甚至难以为继，其中特别是目前结香技术所得沉香产量低，仅在受刺激的木质部周围形成薄层状沉香，采香时在木质部内采香往往极大伤害树木，甚至往往砍伐树干采香，1棵白木香树所产沉香的量受到限制，因此，研究对白木香树伤害较小、可在同一树上反复结香采香的、高效稳定的人工结香技术有重要的实际意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于提供一种对白木香树伤害较小，可在同一树干上反复结香、采香的、稳定高效的结香方法。
本发明采用的技术原理一是：沉香源植物在受到外界刺激后才能形成沉香，而健康沉香源植物不能形成沉香，本发明中提出，失水为沉香源植物形成沉香的刺激因素之一，如在白木香木质部制造机械创伤，其创口就是向外散失水分的开口，木质部中的水分可通过导管、射线、内含韧皮部等细胞通道或细胞孔隙向空气中蒸发，水分的散失使木质部创口内侧细胞也面临死亡，而如果水分散失十分急剧，则细胞在未形成更多次生代谢产物（沉香）时就死亡，因此本发明通过以塑料薄膜包裹创口，使水分散失较为缓和，则细胞可在更长时间保持在濒死状态下，由此可积累更多次生代谢产物。
本发明采用的技术原理二是：研究中发现内含韧皮部可脱分化和再分化出完整次生维管组织系统、皮层、周皮，可向下输送营养物质，甚至环剥至表层木质部，树木仍继续生长，并形成包含木质部、形成层、韧皮部、皮层、周皮的再生组织，因此剥皮结香处理对白木香树的伤害小，同时所形成沉香层在再生组织外侧，便于采香，且采香对白木香树伤害小。
为解决上述技术问题，基于上述原理，本发明采用如下技术方案：
一种剥皮法诱导沉香形成的方法，包括树皮剥皮、包裹薄膜、表面采香工序，是在白木香树干上以刀具剥皮剥除白木香树皮，然后以塑料薄膜包裹剥皮创口，4~12个月后取下薄膜，可见创口表面形成黄褐色沉香层和或树皮，以刀具将新树皮表面形成的黄褐色沉香层取下，得到的沉香层参照国家林业局发布的行业标准lyt2904-2017《沉香》进行醇溶性抽出物含量、高效液相（hplc）和气质联用（gc-ms）分析，其醇溶性抽出物含量大于10%，达到标准要求，hplc图谱特征与标准规定相符，gc-ms分析可检测到芳香族、倍半萜和色酮类化合物。
所述树皮剥皮是以刀具将白木香树干上的树皮剥除，剥皮程度包括创伤至形成层和创伤至木质部，剥皮部位为树干。
所述包裹薄膜是将不透水的塑料薄膜贴紧树干缠绕，将创口全部包裹在薄膜下，确保创口蒸发出的水分不会大量散失，可过夜后观察，如果薄膜内侧凝集水珠，说明水分被薄膜阻隔而凝集。
所述表面采香是在包裹薄膜12个月后将薄膜揭开取下，以刀具将创口表面的黄褐色沉香层剥下，树木仍继续生长，可进行下一次剥皮结香。
本发明的有益效果包括以下几个方面：
1本发明所述剥皮结香方法，对白木香树伤害较小，可在同一树干上反复结香、采香，多次采香可提高单株白木香树产量。
2本发明所述剥皮结香方法，为机械创伤法结香，相对大多数化学试剂类结香法安全且方法简单，结香效果稳定，为沉香产业发展提供了一种新的简便有效的结香方法。
附图说明
图1为实施例1中剥皮至形成层的剥除组织的解剖图。
图2为实施例1中剥皮至形成层并包裹薄膜12个月后创口解剖图。
图3为实施例1中剥皮至形成层并包裹薄膜12个月后沉香样品hplc图谱。
图4为实施例2中剥皮至木质部的剥除组织的解剖图。
图5为实施例2中剥皮至木质部并包裹薄膜12个月后创口解剖图。
图6为实施例2中剥皮至形成层并包裹薄膜12个月后沉香样品hplc图谱。
具体实施方式
下面用非限定性实施实例对本发明作进一步说明。
实施例1：
——剥皮至形成层包裹薄膜结香
（1）结香方法及观察分析方法
在中山市五桂山沉香基地选取6~7年生白木香树3棵，剥皮宽度10cm，在树干上以美工刀横割一圈，距离10cm再横割一圈，两圈之间纵割一刀，割断韧皮部为宜，然后挑开树皮，沿刀口撕下树皮。剥皮后的树干上以美工刀和凿子取木块样，立即以福尔马林溶液浸泡固定，带回实验室进行解剖观察，观察剥皮至形成层处理下组织创伤情况。12个月后，取下薄膜，以美工刀和凿子取木块样，立即以福尔马林溶液浸泡固定，带回实验室进行解剖观察，观察树皮和沉香层形成情况。以美工刀割取表层褐色沉香层，干燥后进行醇溶性抽出物含量、hplc和gc-ms分析。
解剖观察方法详述如下。
样品包埋。将试样修成约1cm边长的小方块，浸泡于水中，以水循环式真空泵抽真空饱水至木块沉底，以自来水冲洗1次，浸泡于水中30min后再洗涤，反复浸泡洗涤3次，于peg（分子量1500）的水溶液（体积比）中逐级脱水包埋，peg浓度（体积比）分级为30%，50%，70%，100%，包埋的时间为每级浓度24h~30h，包埋温度为60℃，peg浓度顺序为30%一次，50%一次，70%一次，100%一次，100%两次。peg溶液体积至少为木块体积的3倍，并浸没木块样品。切片。包埋后的木块样品放在木质底座上冷却固定，以leica2000滑走式切片机切18μm~25μm切片，切片以过滤水洗净peg。拍照观察。以尼康80i生物数码显微镜观察组织、细胞形态、内含物等构造。尼康80i生物数码显微镜荧光波长为330~380μm，可观察细胞壁木质化情况，偏光可观察纤维素降解及晶体分布。
醇溶性抽出物含量方法详述如下。
将干燥后的样品，称取2g（准确至0.001g），置于250ml的干燥的磨口三角瓶中，加入95%乙醇100ml，以磨口瓶塞封口称重（准确至0.001g），静置1h后，连接回流冷凝管，放在水浴锅上加热至沸腾，并保持微沸1h后，待三角瓶冷却，取下三角瓶，以磨口瓶塞封口，擦干三角瓶，再称重（准确至0.001g），用95%乙醇补足损失的重量，摇匀；用定性滤纸（中速）放于漏斗上过滤样品抽提液。对已干燥后冷却至恒重的蒸发皿称重，记为m2，用于盛放25ml过滤液，置于已干燥后冷却至恒重的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干后，再放入103±2℃条件下的烘箱中干燥3小时，置于装有硅胶干燥剂的玻璃干燥室中冷却后迅速称重，记为m1。同一样品同时分为两组进行测定，两次测定值间的绝对误差不超过0.3%，取其算术平均值并保留至小数点后第三位。乙醇抽出物含量x（%）按下式计算。
式中：
m1——蒸发皿的质量，g；
m2——乙醇抽出物和蒸发皿的质量，g；
ms——样品的质量，g；
w——样品中的水分，%
高效液相（hplc）分析方法详述如下。
hplc制样：取沉香样品粉末约0.2g，置于样品管中，加入95%乙醇10ml，密封，称量，静置30min，超声处理60min（功率250w，频率20khz），放冷30min，再称量，用95%乙醇补足减少的质量，摇匀静置，上清液用0.45μm有机微孔过滤膜滤过，取滤液备用。
hplc色谱条件：色谱柱为diamonsilc18（250mm×4.6mm×5μm），十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相a，0.1%甲酸溶液为流动相b，进样量10μl，柱温32℃，流速0.7ml/min，检测波长252nm，梯度洗脱程序为：0～10min，15%～20%a；10~19min，20%~23%a；19~21min，23%~33%a；21~39min，33%a；39~40min，33%~35%a；40~50min，35%a；50~60min，95%a。所得谱图采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723版）进行数据处理。
气质联用（gc-ms）分析方法详述如下。
乙醇超声抽提法。取0.5g（准确至0.001g）粉碎后（40-60目）的沉香样品，加入15ml无水乙醇，超声水浴处理2h，加入60℃水继续超声水浴处理1h，放冷，用电动离心机离心20min，取上层清液浓缩至2ml备用。
气相色谱实验条件描述如下。色谱柱为型号为db-17（30m×0.25mm×0.25μm）的弹性石英毛细管柱，载气为高纯氦气，氦气流速为1.0ml/min，进样量为2μl，不分流进样，进样口温度为230℃。升温程序：起始60℃，保持5min，20℃/min升温到170℃，保持5min，5℃/min升温到210℃，保持5min，20℃/min升温到290℃，保持15min。质谱条件描述如下。离子源为ei离子源，离子源温度为200℃，电离能为70ev。对比nist11数据库和相关参考文献鉴定成分。
（2）观察结果
解剖观察结果表明，剥皮剥除部分含部分形成层及外侧组织，12个月后创口表面深色次生代谢产物沉积于内含韧皮部、木射线、木纤维中，创口再生出木质部和部分韧皮组织。
平均醇溶性抽出物含量为19.22%，达到标准lyt2904-2017要求。
hplc图谱特征与标准相符合。
gc-ms分析检测到芳香族类、倍半萜类和色酮类化合物（表1）。
表1剥皮至形成层包裹薄膜结香gc-ms分析
实施例2：
——剥皮至木质部包裹薄膜结香
（1）结香方法
2017年12月7日，在中山市五桂山沉香基地选取6~7年生白木香树3棵，剥皮宽度100cm，以美工刀横割一圈，距离100cm再横割一圈，深达木质部，刀从上面的圈向下面的圈削下，两圈之间树干均削除1mm~2mm厚的木质部及外侧组织，包裹薄膜2~3层，后续采样方法与观察分析方法与实施实例2相同。
（2）观察分析结果
解剖观察结果表明剥皮剥除组织含部分木质部及其外侧组织，12个月后创口表面深色次生代谢产物沉积于内含韧皮部、木射线中，创口再生出树皮和木质部。
平均醇溶性抽出物含量为15.37%，达到标准lyt2904-2017要求。
hplc图谱特征与标准相符合。
gc-ms分析检测到芳香族类、倍半萜类和色酮类化合物（表2）。
1.一种通过剥皮诱导沉香形成的方法，其特征是在白木香树干上，用刀具剥下树皮，然后以塑料薄膜包裹剥皮创口，12个月后取下薄膜，树干表面形成的黄褐色薄层即为沉香层，以刀具割取表面沉香层即得沉香。
2.如权利要求1所述的剥皮方法，其特征在于，剥除树干部分树皮或环剥树干树皮。
3.如权利要求1所述的剥皮方法，其特征在于，剥皮创伤至形成层或木质部。
4.如权利要求1所述的以塑料薄膜包裹剥皮创口，其特征在于，薄膜需紧贴树干，包裹2~3层，确保创口蒸发出的水分不会大量散失。
技术总结