本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种栎松茸培养基及其应用。
背景技术：
栎松茸，为口蘑科口蘑属大型真菌的子实体，拉丁学名：tricholomabakamatsutake，栎松茸是一种珍惜食药用真菌，含有18种氨基酸、14种人体必需微量元素、49种活性营养物质、5种不饱和脂肪酸、8种维生素、丰富的膳食纤维和多种活性酶，另含有双链松茸多糖、松茸多肽和松茸醇，是世界著名的天然食药用菌类。松茸不仅营养均衡、充足，而且还有提高免疫力、抗癌抗肿瘤、治疗糖尿病及心血管疾病、抗衰老等多种功效。
栎松茸是典型的外生菌根真菌，其生长和繁殖必须要依赖寄主植物—辽东栎或蒙古栎等多种栎属树木获取碳源，才能够在野外形成子实体，同时其产量也因不同气候条件而有较大变化，因此其价格昂贵。在人工培养条件下，栎松茸菌丝体的生长对环境要求相对苛刻，在普通的人工培养基上菌丝生长极其缓慢，至今为止还不能在人工培养基上形成子实体。部分外生菌根真菌能够用仿生栽培的方法，也就是在野外用培养的菌丝体人工接种到栎树树木的根部，使寄主感染栎松茸菌丝的方法，完成接种，经过数年的树木生长周期，在野生条件下形成子实体。但仿生栽培方法需要借助大量在人工培养基上繁殖的菌丝体，栎松茸菌丝体人工培养缓慢的现状制约了该菌难以大范围进行仿生栽培。因此，能够快速培养栎松茸的人工培养基和进行仿生栽培的固态接种菌剂，是限制对该菌进行室内人工栽培研究和野外仿生栽培的主要制约因素。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能够快速培养栎松茸培养基及其应用，本发明提供的栎松茸培养基能够使栎松茸菌丝在人工培养条件下生长活力增加，菌丝体生物量增多，缩短菌丝体培养周期，能够大量获得栎松茸菌丝体并应用于大规模培养研究和野外仿生栽培的接种，从而达到更加高效快速的培养；原料来源丰富、成本低廉、制备工艺简单、使用方便，无毒无害，是一种绿色的培养基，保证了栎松茸菌丝和接种菌剂的质量。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案；
本发明提供了一种栎松茸培养基，含有液体培养基，所述液体培养基包括以下质量份的组分：30～35份马铃薯粉、3～5份麦芽浸粉、1～3份酵母粉、1～3份蛋白胨、0.5～1.5份酒石酸铵、0.004～0.006份柠檬酸铁、0.5～1.5份干果粉和1000份水；
优选的，所述液体培养基的ph为4.0～5.5。
优选的，所述干果粉包括软枣猕猴桃粉、刺五加粉和玫瑰花瓣粉；所述软枣猕猴桃粉、刺五加粉和玫瑰花瓣粉的质量比为70～80：15～28：2～5；所述干果粉的粒径为小于0.85mm。
优选的，所述干果粉的制备方法包括将软枣猕猴桃、刺五加和干玫瑰花瓣依次进行烘干、粉碎和过筛处理；所述烘干的温度为40～60℃，时间为48～72h。
优选的，所述的栎松茸培养基，还含有与所述液体培养基独立分装的固态培养基质；所述固态培养基质包括火山渣；所述火山渣的含水量为40～50％。
本发明还提供了上述技术方案所述栎松茸培养基在快速培养栎松茸的应用，包括以下步骤：
(1)采用所述液体培养基对栎松茸进行培养，得到栎松茸液态发酵菌剂；
(2)将所述栎松茸液态发酵菌剂与灭菌后的固态培养基质混合，进行固态培养，得到固态接种菌剂；
(3)将所述固态接种菌剂接种于栎属树木的根部。
优选的，步骤(1)所述菌种的质量与液体培养基的体积比为2～3g：100～150ml；所述培养的温度为28～32℃；所述培养的时间为25～35天；所述培养为避光培养。
优选的，步骤(2)所述栎松茸液态发酵菌剂的体积与固态培养基质的质量比为1ml：3～5g；所述固态培养为避光培养；所述固态培养的温度为28～32℃；所述固态培养的时间为10～15天。
优选的，步骤(3)所述接种的比例为40～60g/棵；所述栎属树木为辽东栎或蒙古栎。
优选的，所述栎属树木为2～5年生幼树。
本发明提供了一种栎松茸培养基及其应用，该栎松茸培养基，含有液体培养基，所述液体培养基包括以下质量份的组分：30～35份马铃薯粉、3～5份麦芽浸粉、1～3份酵母粉、1～3份蛋白胨、0.5～1.5份酒石酸铵、0.004～0.006份柠檬酸铁、0.5～1.5份干果粉和1000份水。马铃薯粉提供真菌生长的碳源，麦芽浸粉、酵母粉和蛋白胨提供真菌生长所需的多种蛋白质和氮源的基础上，酒石酸铵、柠檬酸铁提供碳源同时调节培养基酸碱度；干果粉混合物进一步提供多种维生素和氨基酸等物质。本发明提供的栎松茸培养基能够使栎松茸菌丝在人工培养条件下生长活力增加，菌丝体生物量增多，缩短菌丝体培养周期，能够大量获得栎松茸菌丝体并应用于大规模培养研究和野外仿生栽培的接种，从而达到更加高效快速的培养；原料来源丰富、成本低廉、制备工艺简单、使用方便，无毒无害，是一种绿色的培养基，保证了栎松茸菌丝和接种菌剂的质量。
具体实施方式
本发明提供了一种栎松茸培养基，含有液体培养基，所述液体培养基包括以下质量份的组分：30～35份马铃薯粉、3～5份麦芽浸粉、1～3份酵母粉、1～3份蛋白胨、0.5～1.5份酒石酸铵、0.004～0.006份柠檬酸铁、0.5～1.5份干果粉和1000份水。
如无特殊说明，本发明对各组分的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明提供的一种栎松茸培养基，含有液体培养基。以质量份计，本发明液体培养基进一步优选包括31～35份马铃薯粉，更优选为31～34份。所述马铃薯粉优选为马铃薯干粉；本发明对马铃薯干粉没有特殊要求，采用本领域常规马铃薯干粉即可。马铃薯粉能够为真菌提供生长的碳源。
以马铃薯粉的质量份为基准，本发明液体培养基进一步优选包括3.5～5份麦芽浸粉，更优选为3.5～4.5份。本发明对麦芽浸粉没有特殊要求，采用本领域常规麦芽浸粉即可。麦芽浸粉的作用为提供真菌生长所需的多种蛋白质和氮源。
以马铃薯粉的质量份为基准，本发明液体培养基进一步优选包括1.5～3份酵母粉，更优选为1.5～2.5份。本发明对酵母粉没有特殊要求，采用本领域常规酵母粉即可。酵母粉的作用为提供真菌生长所需的多种蛋白质和氮源。
以马铃薯粉的质量份为基准，本发明液体培养基进一步优选包括1.5～3份蛋白胨，更优选为1.5～2.5份。本发明对蛋白胨没有特殊要求，采用本领域常规蛋白胨即可。蛋白胨的作用为提供真菌生长所需的多种蛋白质和氮源。
以马铃薯粉的质量份为基准，本发明液体培养基进一步优选包括0.6～1.4份酒石酸铵，更优选为1～2份。本发明对酒石酸铵没有特殊要求，采用本领域常规酒石酸铵即可。酒石酸铵的作用为提供碳源同时调节培养基酸碱度。
以马铃薯粉的质量份为基准，本发明液体培养基进一步优选包括0.005～0.006份柠檬酸铁，更优选为0.005份。本发明对柠檬酸铁没有特殊要求，采用本领域常规柠檬酸铁即可。柠檬酸铁的作用为提供碳源同时调节培养基酸碱度。
以马铃薯粉的质量份为基准，本发明液体培养基进一步优选包括0.6～1.4份干果粉，更优选为0.7～1.3份。所述干果粉优选包括软枣猕猴桃粉、刺五加粉和玫瑰花瓣粉，所述软枣猕猴桃粉、刺五加粉和玫瑰花瓣粉的质量比优选为70～80：15～28：2～5，进一步优选为70～80：20：2～5；所述干果粉的粒径优选为小于0.85mm。在本发明中，所述干果粉的制备方法优选包括：将软枣猕猴桃、刺五加和干玫瑰花瓣依次进行烘干、粉碎和过筛处理，得到所述干果粉；所述烘干的温度优选为40～60℃，时间优选为48～72h；所述过筛用筛网优选为20目筛。干果粉的作用为提供多种维生素和氨基酸等物质。
以马铃薯粉的质量份为基准，本发明液体培养基进一步优选包括1000份水。本发明对水没有特殊要求，采用本领域常规水即可。水的作用为溶解和混合各种培养基成分，为真菌生长提供液体培养环境。
在本发明中，所述液体培养基优选加入琼脂变成固态，加入琼脂后可以使液体培养基凝固变成固态；所述液体培养基的ph优选为4.0～5.5，最优选为4.5。适宜的ph能够增加栎松茸的活力，加快其生长速度。
在本发明中，所述的栎松茸培养基还含有与所述液体培养基独立分装的固态培养基质；所述固态培养基质优选包括火山渣，进一步优选为火山渣；所述火山渣的含水量优选为40～50wt％。火山渣能够提供多孔固态基质，培养液浸入多孔介质中，表面积增大，菌丝生物量增多，同时增加真菌菌丝对不良环境的抵抗力。
本发明还提供了上述技术方案所述栎松茸培养基在快速培养栎松茸的应用，包括以下步骤：
(1)采用所述液体培养基对栎松茸进行培养，得到栎松茸液态发酵菌剂；
(2)将所述栎松茸液态发酵菌剂与灭菌后的固态培养基质混合，进行固态培养，得到固态接种菌剂；
(3)将所述固态接菌剂接种于栎属树木上。
本发明将菌种与液体培养基混合，培养，得到栎松茸液态发酵菌剂。在本发明中，所述混合的方式优选为接种，具体为将菌种接种于液体培养基中；所述菌种的质量与液体培养基的体积比优选为2～3g：100～150ml；所述培养的温度优选为28～32℃，更优选为29～31℃；所述培养的时间优选为25～35天。少量的试管菌种需要进行扩大培养，采用该方法进行真菌菌丝扩增繁殖。
得到栎松茸液态发酵菌剂后，本发明将栎松茸液态发酵菌剂与灭菌后的火山渣固态基质混合，固态培养，得到固态接种菌剂。在本发明中，所述灭菌的方式优选为高压灭菌；所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间优选为40～50min；所述栎松茸液态发酵菌剂的体积与固态培养基的质量比优选为1ml：3～5g；所述固态培养优选为避光培养；所述固态培养的温度优选为28～32℃；所述固态培养的时间优选为10～15天。经过液态发酵菌剂和火山渣固态基质混合培养，栎松茸菌丝体在多孔介质中大量繁殖，菌丝生物量增多，达到适合进行野外接种的条件。固态接种菌剂更容易携带，同时在野外接种栎树后，增加了真菌菌丝对不良环境的抵抗力。
得到固态接菌剂后，本发明将固态接菌剂接种于栎属树木上。在本发明中，所述接种的比例优选为40～60g/棵；所述栎属树木优选为2～5年生幼树；所述栎属树木优选包括辽东栎或蒙古栎。本发明对于接种方法没有特殊限定，采用本领域常规接种方法即可。固态接种菌剂携带的栎松茸菌丝体在辽东栎根部土壤中生长扩展，能够快速与根尖形成菌根，进而长出子实体蘑菇。
下面结合实施例对本发明提供的一种栎松茸培养基及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取软枣猕猴桃、刺五加果、玫瑰花瓣，在60℃烘箱内烘干72h，粉碎后混合，过20目筛，得干果粉；
取马铃薯干粉32g，麦芽浸粉4g，酵母粉2g，蛋白胨2g，干果粉混合物1g(含有软枣猕猴桃粉0.8g，刺五加粉0.15g，干玫瑰花瓣粉0.05g)，酒石酸铵1g，柠檬酸铁5mg，加水1000ml，ph值4.5，搅拌均匀，煮沸充分溶解各组分养分物质，得到液体培养基；
取100ml液体培养基于250ml锥形瓶中分装，棉塞封口，于121℃下灭菌20分钟，取出后冷却至室温，按菌丝质量与液体培养基体积比为2g：100ml的比例，将栎松茸菌丝接种于液体培养基中，于28℃下，120rpm震荡培养30天，得到液体发酵菌剂。
取火山渣3000g，过10目筛，使之直径约2mm，洗去浮尘，沥干水分至手握火山渣无滴落的水滴(含水约50％)，分装至200ml广口玻璃瓶中(每瓶约150g)，透气膜封口，于121℃下高压灭菌40分钟，冷却至室温后，在超净工作台中按液态发酵菌剂的体积与火山渣固态基质的质量比1ml：4g的比例加入上述液态发酵菌剂，搅拌均匀，在28～32℃下避光静置培养15天，得到固态发酵菌剂用于野外仿生栽培接种。
选取2年生的辽东栎或蒙古栎幼苗，在树木的根系外围的细根土壤表面，用直径2cm的打孔器在2个相对的方向打2个10cm深的洞，用灭菌的小勺将固态接种菌剂接种于洞内，每棵接种30g固态接种菌剂，加蒸馏水10ml，覆土盖住小洞，接种完毕。接种75天后，打开接种处的覆土，可见白色团状真菌菌丝，并与辽东栎幼苗根部形成菌根状，接种成功。
实施例2
取软枣猕猴桃、刺五加果、玫瑰花瓣，在60℃烘箱内烘干72h，粉碎过20目筛，得多种干果粉；
取200g去皮鲜土豆切碎，加水1000ml，煮沸至没有固形物，3层纱布过滤后，加入麦芽浸粉4g，酵母粉2g，蛋白胨2g，酒石酸铵1g，柠檬酸铁5mg，干果粉1g(软枣猕猴桃粉0.7g，刺五加粉0.28g，干玫瑰花瓣粉0.02g)，搅拌均匀，ph值4.5，得到液体培养基；
取120ml所得液体培养基于250ml锥形瓶中分装，棉塞封口，于121℃下灭菌20分钟，冷却至室温，按菌丝质量与液体培养基的体积比为3g：120ml的比例，将栎松茸菌丝接种于液体培养基中，于30℃下，140rpm震荡培养30天，得到液体发酵菌剂。
取火山渣4000g，过10目筛，使之直径约2mm，洗去浮尘，沥干水分至手握火山渣无滴落的水滴(含水约50％)，分装至300ml广口玻璃瓶中(每瓶约230g)，透气膜封口，于121℃下高压灭菌50分钟，冷却至室温后，在超净工作台中加入上述液态发酵菌剂，栎松茸液态发酵菌剂的体积与固态培养基质的质量比为1ml：3g，搅拌均匀，在32℃下避光静置培养12天，所得固态发酵菌剂用于野外仿生栽培接种。
选取5年生的辽东栎或蒙古栎幼苗，在树木的根系外围的细根土壤表面，用直径2cm的打孔器在2个相对的方向打2个10cm深的洞，用灭菌的小勺将固态接种菌剂接种于洞内，每棵接种30g固态接种菌剂，加蒸馏水10ml，覆土盖住小洞，接种完毕。接种75天后，打开接种处的覆土，可见白色团状真菌菌丝，并与辽东栎幼苗根部形成菌根状，接种成功。
测试例1
对栎松茸进行培养，
处理一：按文献1(长白山区松口蘑与栎松口蘑菌丝在不同培养基上生长情况，作者：吴松权，全雪丽，傅伟杰，吴基日，北方园艺，2006)的方法进行培养，使用山楂干20g，马铃薯400g，黑木耳原种500g，糖40g，琼脂40g，水2000ml，ph5.5配置的培养基，24℃下，经60天培养；
处理二：按文献2(长白山区栎松口蘑菌丝分离及纯培养初步研究，全雪丽，傅伟杰，吴基日，辽宁林业科技，2006)的方法进行培养，菠萝100g，琼脂100g，淀粉100g，豆浆30g，糖100g，黑木耳原种菌丝650g，水5000ml，24℃下，经60天培养；
处理三：采用实施例1的液体培养基加15％的琼脂倒平皿接种栎松茸进行培养，28℃培养条件下，经30天培养；
处理四：采用实施例2的液体培养基加15％的琼脂倒平皿接种栎松茸进行培养，28℃培养条件下，经30天培养。
实验结果：经处理一培养栎松茸的菌丝直径达4.47cm。经处理二培养栎松茸的菌丝平均每天生长0.6mm，即60天生长3.6cm。处理三中使用本发明实施例1的培养基培养30天左右菌丝的直径可以长至4.8cm左右，处理四中使用本发明实施例2的培养基培养30天左右菌丝的直径可以长至4.7cm左右。表明本发明提供的培养基较文献中栎松茸培养方法更快速的生长。
测试例2
采用实施例1的液体培养基对栎松茸在30℃下，140rpm震荡培养30天，得到栎松茸液态发酵菌剂，观察并记录菌丝的生长情况。
培养30天所得栎松茸液态发酵菌剂的菌丝团呈小球状，直径1～2mm，菌丝干重可达2.7g/l(每升培养基产2.7g菌丝)，说明实施例1的液体培养基能够使栎松茸生长活力增加，菌丝体生物量增多。
本发明提供了一种栎松茸培养基及其应用，本发明提供的栎松茸培养基能够使栎松茸菌丝在人工培养条件下生长活力增加，菌丝体生物量增多，缩短菌丝体培养周期，能够大量获得栎松茸菌丝体并应用于大规模培养研究和野外仿生栽培的接种，从而达到更加高效快速的培养；原料来源丰富、成本低廉、制备工艺简单、使用方便，无毒无害，是一种绿色的培养基，保证了栎松茸菌丝和接种菌剂的质量。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
1.一种栎松茸培养基，其特征在于，含有液体培养基，所述液体培养基包括以下质量份的组分：30～35份马铃薯粉、3～5份麦芽浸粉、1～3份酵母粉、1～3份蛋白胨、0.5～1.5份酒石酸铵、0.004～0.006份柠檬酸铁、0.5～1.5份干果粉和1000份水。
2.根据权利要求1所述的栎松茸培养基，其特征在于，所述液体培养基的ph为4.0～5.5。
3.根据权利要求1所述的栎松茸培养基，其特征在于，所述干果粉包括软枣猕猴桃粉、刺五加粉和玫瑰花瓣粉；所述软枣猕猴桃粉、刺五加粉和玫瑰花瓣粉的质量比为70～80：15～28：2～5；所述干果粉的粒径为小于0.85mm。
4.根据权利要求1所述的栎松茸培养基，其特征在于，所述干果粉的制备方法包括将软枣猕猴桃、刺五加和干玫瑰花瓣依次进行烘干、粉碎和过筛处理；
所述烘干的温度为40～60℃，时间为48～72h。
5.根据权利要求1～4任一项所述的栎松茸培养基，其特征在于，还含有与所述液体培养基独立分装的固态培养基质；所述固态培养基质包括火山渣；所述火山渣的含水量为40～50wt％。
6.权利要求1～5任一项所述栎松茸培养基在快速培养栎松茸中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用所述液体培养基对栎松茸进行培养，得到栎松茸液态发酵菌剂；
(2)将所述栎松茸液态发酵菌剂与灭菌后的固态培养基质混合，进行固态培养，得到固态接种菌剂；
(3)将所述固态接种菌剂接种于栎属树木的根部。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述菌种的质量与液体培养基的体积比为2～3g：100～150ml；所述培养的温度为28～32℃；所述培养的时间为25～35天；所述培养为避光培养。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述栎松茸液态发酵菌剂的体积与固态培养基质的质量比为1ml：3～5g；
所述固态培养为避光培养；
所述固态培养的温度为28～32℃；所述固态培养的时间为10～15天。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述接种的比例为40～60g/棵；所述栎属树木为辽东栎或蒙古栎。
10.根据权利要求6或9所述的应用，其特征在于，所述栎属树木为2～5年生幼树。
技术总结