本发明属于马铃薯试管薯诱导技术领域，具体涉及一种诱导马铃薯生成试管薯的液体培养基、培养方法及应用。
背景技术：
马铃薯试管薯诱导是继试管苗之后研究发现的一种生产种薯和保存种质的新方法。它具有生产不受季节限制、周期短，所需设备简单，贮藏和运输成本低，繁殖速度快、移栽成活率高等优点，是生产脱毒马铃薯的发展方向。
但是目前在进行马铃薯试管薯的诱导时，激素用量大，单一激素使用量最高可达300mg/l，且结薯时间长，大薯率低。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导马铃薯生成试管薯的液体培养基、诱导方法及应用，所述诱导培养基可加速试管薯的形成，且显著提高大薯率，增加试管薯产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种诱导马铃薯生成试管薯的液体培养基，所述液体培养基以ms为基本培养基，还包括蔗糖和植物激素；所述植物激素包括组合激素或单一激素，所述组合激素包括：0.1～0.4mg/l的naa、0.5～2mg/l的6-ba和3～9mg/l的ccc；所述单一激素包括5～15mg/l的ccc；所述蔗糖的浓度为80g/l。
优选的，所述组合激素包括：0.4mg/l的naa，0.5mg/l的6-ba，9mg/l的ccc。
优选的，所述单一激素为10mg/l的ccc。
本发明还提供了一种诱导马铃薯生成试管薯的方法，在所述液体培养基上接种马铃薯幼苗，在18±1℃的温度下进行暗培养。
优选的，在所述接种前，所述马铃薯幼苗还包括在壮苗半固体培养基中进行壮苗培养，所述壮苗培养基以ms为基本培养基，包括：30g/l的蔗糖，2.5g/l的琼脂和0.05mg/l的naa。
优选的，所述壮苗培养的温度为20±1℃，光照强度为2000lx，光照时间8h/d，所述壮苗培养的时间为10～15d。
本发明还提供了所述液体培养基或所述方法在提高马铃薯试管薯大薯产量中的应用。
本发明还提供了所述液体培养基或所述方法在马铃薯试管薯快速产薯中的应用。
本发明提供了一种诱导马铃薯生成试管薯的液体培养基，所述液体培养基以ms为基本培养基，还包括蔗糖和植物激素；所述植物激素包括组合激素或单一激素，所述组合激素包括：0.1～0.4mg/l的naa、0.5～2mg/l的6-ba和3～9mg/l的ccc；所述单一激素包括5～15mg/l的ccc；所述蔗糖的浓度为80g/l。本发明所述液体培养基成分简单，方便制作和灭菌，后期污染率低。在本发明所述液体培养基中，所述naa可诱导马铃薯在壮苗期产生不定根，并促进细胞的分裂和扩大；所述6-ba可有效抑制叶绿素降解并提高植物体内氨基酸的含量,同时解除体内源生长素等对腋芽的抑制，利于营养物质向细胞分裂素所在部位运输，诱导块茎的产生；所述ccc(矮壮素)可使试管苗节间缩短,茎粗、叶片数和有效扩繁节段数增加。将所述naa、6-ba和ccc混合后，可有效地调节植株生长发育过程，缩短结薯周期，提高大薯率和单株产量。本发明所述液体培养基中激素含量较低，尤其是利用单一激素时，ccc含量更低，且试管薯结薯周期短。
进一步的，本发明还提供了一种诱导马铃薯生成试管薯的方法，利用所述液体培养基和所述方法，有效地缩短了初始结薯天数和快速增长天数，且大薯率、大薯平均重量和单株终产量都显著提高。在本发明实施例中，对大西洋和陇薯3号经过3～5d的诱导就产生试管薯，并进入快速生长时期，在诱导20d时，大薯率最高可达62.5％或59.9％，大薯平均质量最高可达0.2385g或0.2270g，单株最高产量可达0.3198g或0.3876g。
附图说明
图1为大西洋和陇薯3号单激素处理与复合激素处理的结薯生长点对比图；
图2为实施例1中c8组抽样调查结果图；
图3为实施例1中ck组抽样调查结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种诱导马铃薯生成试管薯的液体培养基，所述液体培养基以ms为基本培养基，还包括蔗糖和植物激素；所述植物激素包括组合激素或单一激素，所述组合激素包括：0.1～0.4mg/l的naa、0.5～2mg/l的6-ba和3～9mg/l的ccc；所述单一激素包括5～15mg/l的ccc；所述蔗糖的浓度为80g/l。
本发明所述液体培养基包括两类，其中一类为复合植物激素，一类为单一激素。当为复合激素时，所述植物激素优选包括：质量浓度为0.4mg/l的naa、质量浓度为0.5mg/l的6-ba和质量浓度为9mg/l的ccc。本发明所述naa可在马铃薯壮苗期利于诱导产生不定根，并促进细胞的分裂和扩大，所述6-ba可有效抑制叶绿素降解并提高植物体内氨基酸的含量，同时解除体内源生长素等对腋芽的抑制，利于营养物质向细胞分裂素所在部位运输，诱导块茎的产生。所述ccc可使试管苗节间缩短，茎粗、叶片数和有效扩繁节段数增加。将所述naa、6-ba和ccc混合后，可有效地调节植株生长发育过程，缩短结薯周期，提高大薯率和单株产量。
当所述激素为单一激素时，所述ccc的质量浓度优选为10mg/l，所述ccc可有效抑制马铃薯试管苗和匍匐茎的伸长,在加速块茎形成的同时降低畸形薯率，提高大薯率和大薯重量。本发明对所述植物激素的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明对所述ms培养基的成分并没有特殊限定，优选包括以下组分：硝酸铵1650mg/l、硝酸钾1900mg/l、氯化钙440mg/l、硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l，碘化钾0.83mg/l，硼酸6.2mg/l，硫酸锰22.3mg/l，硫酸锌8.6mg/l，钼酸钠0.25mg/l，硫酸铜0.025mg/l，氯化钴0.025mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l，硫酸亚铁27.8mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2mg/l，盐酸硫胺素0.1mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，烟酸0.5mg/l。
本发明对所述液体培养基的制备方法并没有特殊限定，优选按照所述比例将原料进行混合即可。本发明制备得到所述液体培养基后，优选还包括灭菌，所述灭菌的温度优选为121℃，压力优选为1.2kg/cm2，灭菌时间优选为15～20min。在本发明实施例中，将灭菌后的所述液体培养基分装至规格为18mm×180mm的试管中，每管20ml。
本发明还提供了一种诱导马铃薯生成试管薯的方法，在所述液体培养基上接种马铃薯幼苗，在18±1℃的温度下进行暗培养。
在本发明的所述方法中，所述接种优选为在无菌条件下接种马铃薯幼苗。本发明在所述接种前，所述马铃薯幼苗还包括在壮苗半固体培养基中进行壮苗培养，所述壮苗培养基以ms为基本培养基，包括：30g/l的蔗糖，2.5g/l的琼脂和0.05mg/l的naa。本发明所述壮苗培养及的ph值优选为5.8。本发明对所述壮苗培养基的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法制备即可，在制备得到所述壮苗培养基后，优选还包括灭菌，所述灭菌的温度优选为121℃，压力优选为1.2kg/cm2，灭菌时间优选为15～20min。本发明对所述壮苗培养基中的各原料来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述壮苗培养基为半固体培养基，在所述壮苗培养基中接种的幼苗优选为含2个腋芽的试管苗中部茎段，约4～5cm。本发明所述壮苗培养的温度优选为20±1℃，光照强度优选为2000lx，光照时间优选为8h/d，所述壮苗培养的时间优选为10～15d。
本发明还提供了所述液体培养基或所述方法在提高马铃薯试管薯大薯产量中的应用。本发明在所述应用时，所述提高马铃薯试管薯大薯产量的方法与上述诱导马铃薯生成试管薯的方法相同，在此不再赘述。
本发明还提供了所述液体培养基或所述方法在马铃薯试管薯快速产薯中的应用。本发明在所述应用时，所述马铃薯试管薯快速产薯的方法与上述诱导马铃薯生成试管薯的方法相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种诱导马铃薯生成试管薯的液体培养基、培养方法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.马铃薯组培苗的繁殖与壮苗
供试材料：栽培品种大西洋
1.1半固体壮苗培养基配制：以ms培养基为基础培养基，添加如下成分：质量浓度为30g/l蔗糖，质量浓度为2.5g/l琼脂和质量浓度为0.05mg/lnaa，调节ph5.8。采用高压蒸汽灭菌法，灭菌温度为121℃，压力1.2kg/cm2，灭菌时间15～20min。
1.2组培苗接种：无菌条件下，剪取含2个腋芽的试管苗中部茎段(4-5厘米)接种至半固体壮苗培养基，每瓶接6个茎段，置于20±1℃、光照强度2000lx、光照时间8h/d的条件下培养10～15d，供实验备用。
2.试管薯液体培养基转接
2.1.液体培养基配制：
以ms培养基为基础培养基，添加质量浓度为80g/l蔗糖，辅加单一生长激素植物激素naa、6-ba或ccc(表1)，调节ph5.8。
表1单一激素的试管薯诱导液体培养基
以上培养基采用高压蒸汽灭菌法，灭菌温度为121℃，压力1.2kg/cm2，灭菌时间15～20min。分装至规格为18mm×180mm的试管中，每管20ml。
2.2组培苗液体培养基的转接：无菌条件下，将1.2中完整带根组培苗分别转接至装有不同植物激素组合的液体培养基试管中，每支试管接种一株苗。转移至全黑暗环境18±1℃培养20d进行收获与指标测定。
3.测定指标
(1)结薯率(％)：结薯株数/总试管苗数。
(2)单株结薯数(个/株)：结薯总数/结薯株数。
(3)大薯率(％)：大薯数/结薯数。
(4)中薯率(％)：中薯数/结薯数。
(5)小薯率(％)：小薯数/结薯数。
(6)薯块平均直径(mm)：结薯直径总和/结薯数。
(7)薯块平均重量(g)：结薯重量总和/结薯数。
(8)大薯平均重量(g)：大薯重量总和/大薯数。
(9)单株最终产量(g)：单薯重量×单株结薯个数。
(10)匍匐茎发生时期(d)：从转接第一天至第一个匍匐茎发生的天数。
(11)初始结薯天数(d)：从转接第一天至第一个微型薯形成的天数。
(12)试管薯快速增长时期(d)：微型薯快速增多增大的时间范围。
(注：试管薯大小(直径mm)：大薯(≥5mm)、中薯(5mm＞直径≥3mm)、小薯(＜3mm)。)
4.实验结果
马铃薯试管薯诱导培养基中添加单一激素ccc，其结薯效果(薯块平均直径、薯块平均重量、大薯平均重量和单株最终产量)明显优于添加naa或6-ba。分别设置添加5mg/l、10mg/l、15mg/l浓度的ccc实验组，结果显示，添加10mg/l的ccc(见表2中c8组)结薯效果最佳，c8组的抽样调查结果如图2所示，ck组的抽样调查结果如图3所示。
表2单一激素处理对大西洋试管薯诱导影响统计分析
注：表中只对大薯率、大薯平均重量和单株最终产量进行差异性显著分析，其中小写字母表示差异性达到显著性水平(p<0.05)。
实施例2
除2.1液体培养基配制与实施例1不同外，其余条件均与实施例1相同，本实施例所用的培养基配制如表3所示：
表3不同植物激素组合的试管薯诱导液体培养基
调节上述培养基ph为5.8，且以上培养基采用高压蒸汽灭菌法，灭菌温度为121℃，压力1.2kg/cm2，灭菌时间15～20min。分装至规格为18mm×180mm的试管中，每管20ml。
于相同时间内，统计与实施例1相同的数据，如表4所示：
表4复合激素处理对大西洋试管薯诱导影响统计分析
注：表中只对大薯率、大薯平均重量和单株最终产量进行差异性显著分析，其中小写字母表示差异性达到显著性水平(p<0.05)。
马铃薯试管薯诱导培养基中添加多种组合激素时，t7组其结薯效果(大薯率、薯块平均直径、薯块平均重量、大薯平均重量和单株最终产量)明显优于其他实验组和对照组，结果显示，添加0.4mg/l的naa、0.5mg/l的6-ba和9mg/l的ccc(见表4中t7组)结薯效果最佳。
实施例3
除品种不同外，其余条件均与实施例1相同，并于相同的时间内测定相同的数据，本实施例的测试品种为：陇薯3号，测试结果如表5所示：
表5单一激素处理对陇薯3号试管薯诱导影响统计分析
注：表中只对大薯率、大薯平均重量和单株最终产量进行差异性显著分析，其中小写字母表示差异性达到显著性水平(p<0.05)。
结果显示，添加10mg/l的ccc(见表5中a8组)结薯效果最佳，与实施例1结果一致。
实施例4
除品种不同外，其余条件均与实施例2相同，并于相同的时间内测定相同的数据，本实施例的测试品种为：陇薯3号，测试结果如表6所示：
表6复合激素处理对陇薯3号试管薯诱导影响统计分析
注：表中只对大薯率、大薯平均重量和单株最终产量进行差异性显著分析，其中小写字母表示差异性达到显著性水平(p<0.05)，大写字母表示差异性达到显著性水平(p<0.01)。
结果显示，表6中s7组结薯效果最佳，与实施例2结果一致。
对实施例1～4的主要生长点数据进行分析，结果如图1所示：单一激素和复合激素处理，都可在接种1d后产生匍匐茎，但是在产生匍匐茎后，两者开始展现区别，单一激素处理比复合激素处理更早发生微型薯、更早进入快速增长以及快速增大阶段，综上可知，单一激素处理较复合激素处理效果更佳。
本发明提供了一种诱导马铃薯生成试管薯的液体培养基、培养方法及应用，采用固体培养基壮苗、液体培养基诱导试管薯，有效地缩短了初始结薯天数和快速增长天数。试管苗茎段自转接之日起，在固体培养基生长10～15d后，转移至液体培养基黑暗条件下诱导试管薯。经过3～5天后，即可发生微型薯，并进入快速增长时期。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种诱导马铃薯生成试管薯的液体培养基，其特征在于，所述液体培养基以ms为基本培养基，还包括蔗糖和植物激素；所述植物激素包括组合激素或单一激素，所述组合激素包括：0.1～0.4mg/l的naa、0.5～2mg/l的6-ba和3～9mg/l的ccc；所述单一激素包括5～15mg/l的ccc；所述蔗糖的浓度为80g/l。
2.根据权利要求1所述液体培养基，其特征在于，所述组合激素包括：0.4mg/l的naa，0.5mg/l的6-ba，9mg/l的ccc。
3.根据权利要求1所述液体培养基，其特征在于，所述单一激素为10mg/l的ccc。
4.一种诱导马铃薯生成试管薯的方法，其特征在于，在权利要求1～3任一项所述液体培养基上接种马铃薯幼苗，在18±1℃的温度下进行暗培养。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，在所述接种前，所述马铃薯幼苗还包括在壮苗半固体培养基中进行壮苗培养，所述壮苗培养基以ms为基本培养基，包括：30g/l的蔗糖，2.5g/l的琼脂和0.05mg/l的naa。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述壮苗培养的温度为20±1℃，光照强度为2000lx，光照时间8h/d，所述壮苗培养的时间为10～15d。
7.权利要求1～3任一项所述液体培养基或权利要求4～6任一项所述方法在提高马铃薯试管薯大薯产量中的应用。
8.权利要求1～3任一项所述液体培养基或权利要求4～6任一项所述方法在马铃薯试管薯快速产薯中的应用。
技术总结