本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法。
背景技术：
苦糖果(lonicerafragrantissimalindl.etpaxt.subsp.standishii(carr.)hsueth.j.wang)属于忍冬科(caprifoliaceae)忍冬属郁香忍冬的亚种。该植物种在中国广泛分布，多生长于海拔100-2000m向阳坡地内或溪涧旁。其果实具有较高的食用和营养价值。
近年来蓝莓和枸杞等小浆果植物种开发较为充分，创造了较好的经济和社会价值，开发新的小浆果植物品种，增添小浆果在市场中的占比份额势在必行。苦糖果属于小浆果类型植物，在中国零星分布，但集中人工种植较少，属于尚未开发的野生植物种质资源，致使其繁育的植物材料非常有限。通过组织培养等生物技术显然是能够快速繁育苦糖果的重要技术手段。
技术实现要素：
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于此，提出本发明。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其包括，将苦糖果越冬枝条的花芽去掉外表皮，留存黄绿色的花芽幼嫩部位；将所述花芽幼嫩部位消毒，接种至培养基上培养；其中，所述培养基为ms基本培养基，附加6-ba激素和/或iba激素，所述6-ba激素与所述iba激素的质量比为1：(1～2)；所述培养的温度为26±1℃，光照强度为4000～6000lx，光照时长为12h的恒温培养箱进行培养15～25天。
作为本发明所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法的优选方案，其中：所述消毒，其为利用酒精、次氯酸钠、升汞进行消毒。
作为本发明所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法的优选方案，其中：所述消毒，其为先用酒精浸泡，再用次氯酸钠浸泡，期间进行翻动，再用无菌水冲洗后用升汞浸泡，期间进行翻动；用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干表面水分即可。
作为本发明所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法的优选方案，其中：所述培养基还包括蔗糖和琼脂粉，按质量份数计，所述蔗糖为300份，所述琼脂粉为90份。
作为本发明所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法的优选方案，其中：所述培养基的ph为5.8。
作为本发明所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法的优选方案，其中：所述培养基经121℃高温灭菌20min后，避光冷却保存待用。
作为本发明所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法的优选方案，其中：所述接种，为保证所述花芽幼嫩部位基部有1～1.5mm嵌入所述培养基内。
作为本发明所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法的优选方案，其中：培育的愈伤组织在分裂期形成的比例为10％以上。
本发明的目的是弥补苦糖果的组织培养技术空白，提供一种利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特殊之处在于包括如下步骤：
1、花芽处理
在苦糖果越冬枝条形态学上端选取形状饱满、表皮深红色的花芽，采芽当天室内解剖镜下使用解剖针剥去花芽外表皮，直至露出黄绿色的幼嫩部分。见图1。
2、花芽消毒灭菌
超净工作台上用无菌滤纸吸干外植体表面水分，首先进行75％酒精浸泡30s后用无菌水冲洗3遍，其次用次氯酸钠浸泡5min，期间上下翻动材料，第三步用无菌水冲洗3-5遍后用0.1％升汞浸泡5min，期间不断搅动外植体材料；之后再次用75％酒精浸泡30s后用无菌水冲洗3遍，最后将材料在无菌水中浸泡5min冲洗3-5遍，然后用无菌滤纸吸干表面水分。
3、培养基配制
采用ms 6-ba0.5mg·l-1 iba1mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，利用0.1mol/lhcl溶液调节ph至5.8，培养器皿分装溶液，用封口膜封包，121℃高温灭菌20min后，避光冷却。
4、接种方式
无菌条件下，将消毒后的花芽接种至培养基上，保证花芽基部有1～1.5mm左右部分嵌入培养基。
5、培养条件
将接种后的培养器皿放置温度为26±1℃，光照强度为4000～6000lx，光照时长为12h的恒温培养箱进行培养25天。
本发明的有益效果：
本发明通过对不同激素浓度进行优选，首次提出利用苦糖果越冬花芽作为供试材料促进其愈伤组织形成的方法，为苦糖果无性繁育方式填补空白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为花芽处理图；
图2为实施例1花芽愈伤组织培育结果图，其中，左侧愈伤组织成活状态更明显，右侧稍差些，两个均已培育成功。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
采用配方为ms 6-ba0.5mg·l-1 iba1mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，其它步骤如发明内容中相同的操作方法进行愈伤组织诱导，成功诱导出苦糖果茎尖植物材料愈伤组织。
实施例2
采用配方为1/2ms 6-ba1.0mg·l-1 iba0.5mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，其它步骤如发明内容中相同的操作方法进行愈伤组织诱导，未能成功诱导出苦糖果茎尖植物材料愈伤组织。
实施例3
采用配方为1/2ms 6-ba0.5mg·l-1 iba1.0mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，其它步骤如发明内容中相同的操作方法进行愈伤组织诱导，未能成功诱导出苦糖果茎尖植物材料愈伤组织。
实施例4
采用配方为ms 6-ba1.0mg·l-1 iba0.5mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，其它步骤如发明内容中相同的操作方法进行愈伤组织诱导，未能成功诱导出苦糖果茎尖植物材料愈伤组织。
实施例5
采用配方为ms 6-ba1.0mg·l-1 iba1.0mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，其它步骤如发明内容中相同的操作方法进行愈伤组织诱导，未能成功诱导出苦糖果茎尖植物材料愈伤组织。
实施例6
采用配方为ms 6-ba0.5mg·l-1 iba0.5mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，其它步骤如发明内容中相同的操作方法进行愈伤组织诱导，未能成功诱导出苦糖果茎尖植物材料愈伤组织。
实施例7
采用配方为1/2ms 6-ba1.0mg·l-1 iba1.0mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，其它步骤如发明内容中相同的操作方法进行愈伤组织诱导，未能成功诱导出苦糖果茎尖植物材料愈伤组织。
实施例8
采用配方为1/2ms 6-ba0.5mg·l-1 iba0.5mg·l-1 蔗糖30g·l-1 琼脂粉9g·l-1，其它步骤如发明内容中相同的操作方法进行愈伤组织诱导，未能成功诱导出苦糖果茎尖植物材料愈伤组织。
本发明选择不同ms培养基类型、6-ba和iba激素浓度进行正交实验，同时培养基母液中蔗糖浓度均为30g·l-1，琼脂粉浓度均为9g·l-1，并利用0.1mol/lhcl溶液调节ph至5.8。每个处理接10个芽，每瓶接2～3个芽，连续进行25d培养观察，记录各处理越冬花芽愈伤组织形成情况(见表1)。
表1不同培养基类型和激素浓度对比情况
整个愈伤组织形成有三个时期，为诱导期，分裂期，分化期。通过上述正交实验观察结果可以看出，实施案例1对于苦糖果越冬花芽愈伤组织的形成是最成功的，使多数花芽产生愈伤组织，并稳定的保持愈伤组织的形成阶段处于分裂期，同时其愈伤组织形成较为密实，总体膨大球径可达1.5～2cm，效果最好，能够为苦糖果组培繁育过程中的继代培养提供大量稳定的繁育材料。表格中，未见增加是接种后，细胞处于诱导期，是一个静止状态，此阶段细胞大小变化不大，属于失败类型；分化期细胞开始停止分裂，形成不同形态和功能的细胞，属于失败类型；而分裂期的愈伤组织不断增生子细胞，经过诱导，外层细胞开始发生细胞分裂，使细胞脱分化，属于成功类型。
在本发明的实施过程中，申请人发现苦糖果越冬花芽的不同剥取程度对其后续的存活状态有较大影响，剥取时应当尽量去除花芽外皮，保留1～2层左右即可，花芽基部尽量剥去外皮，保留2～3mm左右幼嫩部分即可，同时保证已分化好的花芽幼芽无损。若剥取程度较轻，芽体消毒灭菌程度弱，易霉变，剥取程度较重，花芽裸露后消毒灭菌过程易脱水；另外不同激素浓度对花芽的愈伤组织形成过程存在较大影响，本发明通过正交试验设计，优选最适激素浓度方案。综上，根据本发明可以稳定实现苦糖果越冬花芽愈伤组织形成，进而为继代培养提供较多的繁育材料。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
1.一种利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特征在于：包括，
将苦糖果越冬枝条的花芽去掉外表皮，留存黄绿色的花芽幼嫩部位；
将所述花芽幼嫩部位消毒，接种至培养基上培养；
其中，所述培养基为ms基本培养基，附加6-ba激素和/或iba激素，所述6-ba激素与所述iba激素的质量比为1：(1～2)；
所述培养的温度为26±1℃，光照强度为4000～6000lx，光照时长为12h的恒温培养箱进行培养15～25天。
2.如权利要求1所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特征在于：所述消毒，其为利用酒精、次氯酸钠、升汞进行消毒。
3.如权利要求1所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特征在于：所述消毒，其为先用酒精浸泡，再用次氯酸钠浸泡，期间进行翻动，再用无菌水冲洗后用升汞浸泡，期间进行翻动；用无菌水冲洗用无菌滤纸吸干表面水分即可。
4.如权利要求1～3所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特征在于：所述培养基还包括蔗糖和琼脂粉，按质量份数计，所述蔗糖为300份，所述琼脂粉为90份。
5.如权利要求4所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特征在于：所述培养基的ph为5.8。
6.如权利要求5所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特征在于：所述培养基经121℃高温灭菌20min后，避光冷却保存待用。
7.如权利要求1～3、5、6任一所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特征在于：所述接种，为保证所述花芽幼嫩部位基部有1～1.5mm嵌入所述培养基内。
8.如权利要求7所述的利用苦糖果越冬花芽诱导愈伤组织形成的方法，其特征在于：培育的愈伤组织在分裂期形成的比例为10％以上。
技术总结