本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种北沙参快速繁殖方法。
背景技术：
北沙参是山东传统道地药材，也是我国大宗常用药材，而且野生北沙参已被列入国家ⅱ级重点保护野生植物。鉴于此，建立一种离体快繁增殖技术，不仅能够有效地拯救濒危珍稀物种、保护野生植物资源，同时对于优良品种的选育和推广以及工厂化生产皆具有重要意义。
惠红等(植物资源与环境，1996，5:57-58)、李森等(哈尔滨师范大学自然科学学报，2008，24(5):84-86)分别筛选出不同的培养基，采用器官发生的方式，经过诱导、分化、生根等组培繁殖过程，虽成功诱导出试管苗，但是步骤繁琐，且成活率不高。李宏博等(中国中药杂志，2012，37(4)：434-437)通过体细胞胚胎发生的途径诱导出再生植株，但是此过程慢、耗时较长，而且由于继代时长的增加产生大量畸形胚，导致成苗率低。
因此，现有技术急需一种可快速繁殖北沙参的方法。
技术实现要素：
为了解决现有技术的上述不足之处，本发明的目的在于提供一种北沙参一次成苗的组培快繁方法，以解决现有北沙参繁殖方法中存在的步骤繁琐、耗时且成活率不高的技术问题。
本发明的目的及其技术问题的解决，可以采用以下技术方案来实现。
本发明提供了一种北沙参一次成苗的组培快繁方法，包括以下步骤：
1)将北沙参的种子进行灭菌处理；2)将灭菌的种子接种到添加有细胞分裂素、生长素、碳源和琼脂的ms培养基上并培养，诱导产生不定芽和北沙参苗；3)选择健壮的北沙参苗进行穴盘炼苗，并保湿，使北沙参苗长出新叶和根；和4)移栽定植长出新叶和根的北沙参苗。
在本发明方法的实施方案中，在步骤2)，通常培养40-50天即可产生第一批北沙参苗。
本发明与现有技术相比具有明显的有益效果。借由上述技术方案可知，本发明至少具有下列有益技术效果：
培养过程简单易行，仅用一种培养基即可完成组培苗的整个生长过程；简化了北沙参生产的程序，有效地减少了组织培养中多次转接造成的污染；缩短组培苗育苗的周期，不到两个月即可出第一批苗，至少可节省1个月的时间，节约成本，有利于产业化生产；由于减少了继代次数，降低了植株变异几率，继代5次以内畸形苗不足1％，成苗率90％以上。
附图说明
图1显示了瓶内不定芽继代培养一个月后的结果；
图2显示了继代培养增殖倍数大于10；
图3显示了练苗前植株状态；
图4显示了练苗20天长出新叶和根的植株。
具体实施方式
下面将结合具体实施方案对本发明进行清楚、完整的描述，但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的在于，提供一种快速繁殖北沙参秧苗同时降低畸形苗的方法。
为此，本发明提供了一种北沙参一次成苗的组培快繁方法，包括以下步骤：
1)将北沙参的种子进行灭菌处理；
2)将灭菌的种子接种到添加有细胞分裂素、生长素、碳源和琼脂的ms培养基上并培养，诱导产生不定芽和北沙参苗；
3)选择健壮的北沙参苗进行穴盘炼苗，并保湿，使北沙参苗长出新叶和根；和
4)移栽定植长出新叶和根的北沙参苗。
步骤1)北沙参种子的灭菌处理
北沙参的果实为翅果。在对北沙参的种子进行灭菌处理之前，需要去除北沙参果实的果翅，以得到北沙参的种子。
在接种之前，种子的灭菌处理方式是本领域技术人员公知的。在本发明的实施方案中，北沙参种子的灭菌处理包括将北沙参的种子用水冲洗15-45分钟，75％酒精浸泡10-40秒，无菌水冲洗1-2次，0.05-0.15％的升汞浸泡4-12分钟，再用无菌水冲洗3-7次，备用。
在本发明的具体实施方案中，冲洗所用的水可以为自来水、无菌水，冲洗时间可以为15-45分钟，优选25-35分钟，例如15、20、25、30、35、40、45分钟。
在本发明的具体实施方案中，酒精浸泡的目的是进行表面灭菌，浸泡的时间可以为10、15、20、25、30、35、40秒。
在本发明的具体实施方案中，升汞的浓度可以为0.05-0.15％，例如例如0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％，优选0.1％，浸泡的时间可以为4-12分钟，例如4、5、6、7、8、9、10、11、12分钟，优选8分钟。
升汞浸泡后，为了避免升汞对北沙参种子培养过程中不定芽的诱导产生不利影响，用无菌水将经升汞浸泡的种子清洗3-7次，例如3、4、5、6、7，优选5次。
在本发明的实施方案中，在灭菌的过程中，不断摇动，使种子均匀灭菌。
步骤2)北沙参种子的接种和培养
在本发明方法的步骤2)中，接种到添加有细胞分裂素、生长素、碳源和琼脂的ms培养基上并培养，诱导产生不定芽和北沙参苗。
在本发明的实施方案中，细胞分裂素可以选自激动素(kt)、6-苄基氨基嘌呤(6-ba)中的一种或两种，其在ms培养基中的浓度为1-3mg/l，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0mg/l，优选2mg/l。
在本发明的具体实施方案中，生长素可以选自吲哚乙酸(iaa)、萘乙酸(naa)中的一种或两种，其在ms培养基中的浓度可以为0.1-0.5mg/l，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/l，优选0.3mg/l。
在本发明的具体实施方案中，碳源可以选自蔗糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或多种，碳源在ms培养基中的浓度可以为20-40g/l，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40g/l，优选蔗糖30g/l。
在本发明的具体实施方案中，琼脂在ms培养基中浓度为5-8g/l，例如5、6、7、8g/l，优选7g/l。
在本发明的具体实施方案中，在步骤2)中培养条件为22-28℃、12h黑暗 12h光照的条件下进行，且光照强度1500-2500lx。在具体实施方案中，温度可以为22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26℃、26.5、27、27.5、28℃，优选25℃，光照强度可以为1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500lx，优选2000lx。
在本发明的具体实施方案中，诱导培养持续约35-50天即可产生不定芽和北沙参苗。在此过程中，北沙参的种子首先产生不定芽。在不定芽产生后，继续培养约20-40天完成植株的继续发育和生长，同时形成新的不定芽，在此过程中增殖倍数可达到10以上。
步骤3)穴盘练苗，并保湿，使北沙参苗长出新叶和根
在本发明的实施方案中，在步骤3)中挑选健壮的北沙参苗在砂质土壤中进行穴盘练苗,同时保持湿润。在具体实施方案中，练苗持续时间为10-25天，例如可以为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25。
在穴盘练苗的过程中，北沙参苗长出新叶和根。与用腐殖土穴盘练苗相比，在砂质土壤中进行穴盘练苗，北沙参苗更容易生根。
在具体实施方案中，健壮的北沙参苗为株高4-5cm、具有3片以上基生叶的北沙参植株。
在本发明方法的另一实施方案中，可以继续在步骤2)所述的培养基和培养条件下培养挑选后剩余的不定芽和苗，以实现循环增殖。在本发明的实施方案中，可循环增殖至少5代，畸形苗不足1％，例如循环增殖5代、6代、7代、8代。
在本发明的实施方案中，在步骤4)中，移栽定植长出新叶和根的北沙参苗。
借由上述技术方案可知，与步骤繁琐、出苗慢、畸形苗多、成苗率低的现有北沙参繁殖方法相比，本发明的方法至少包括以下优点：本发明建立的北沙参组培快繁方法利用同一培养基即可实现北沙参种子不定芽的诱导和增殖，且缩短了出苗时间，同时解决了由于长时间继代和激素的应用导致畸形苗多、成苗率低的问题。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是，以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
在本实施例中，提供了一种北沙参一次成苗的组培快繁方法，包括如下步骤：
1)北沙参种子灭菌处理：挑选低温沙藏即将发芽的北沙参果实50粒，将其果翅剥离，置于自来水下小水流冲洗30分钟，75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2次后，再用0.1％的升汞浸泡8分钟，期间不断摇动，使其均匀灭菌，用无菌水冲洗5次，取出种子待用。
2)增殖培养：将灭好菌的北沙参种子接种至添加有6-ba(2mg/l)、naa(0.3mg/l)、蔗糖(30g/l)和琼脂(6.5g/l)的ms培养基(ph值为5.8)上，培养基体积约为接种瓶体积的1/3，放在温度为25、℃12h黑暗 12小时光照强度为2000lx的培养室里，进行不定芽的诱导和培养。
培养10天后，北沙参种子逐渐产生不定芽，继续培养1个月，北沙参不定芽发育成苗，同时继续形成新的不定芽，增殖倍数可达到10以上。
3)穴盘炼苗：挑选株高4-5cm、具有3片以上基生叶的健壮北沙参苗，在砂质土壤中进行穴盘炼苗20天，同时保湿。在此过程中，北沙参苗长出新叶和根，可进行移栽定植。
4)移栽定植：将长出新叶的北沙参苗定植于大田，初期遮阴保湿。
5)循环增殖培养：在挑选后，继续用步骤2)中增殖培养挑选后剩下的不定芽和北沙参苗，使其继续产生不定芽、不定芽生长成北沙参苗，并进行步骤3)和步骤4)，从而可以利用同一种培养基实现循环增殖。
实施例1结果：初代培养自不定芽的产生开始，到长出第一批株高4-5cm、具有3片以上基生叶的健壮北沙参苗为止，本实施例需要40天，即最短初培养的时间为40天。继代后营养耗尽为止，约需30天，因此本实施例继代周期为30天。继代30天后，在原来有不定芽的组织块上新产生的植株数加新的不定芽数与原不定芽数的比值为增殖倍数，本实施例中，统计10个带有不定芽的组织块，增殖倍数均在10以上(如图1和2所示，增殖倍数分别为18和12)。株高4-5cm、具有3片以上基生叶的健壮北沙参苗，视为总苗数(如图3为部分用于炼苗的健壮植株)，炼苗后能够产生新叶和根的苗数与总苗数的比值为成苗率。本实施例中，三次炼苗每次50株，20天后，能够长出新叶和根的植株数分别为48、46、49(如图4为部分炼苗后产生新叶和根的植株)，因此成苗率大于90％。初代培养和4次继代所产生的畸形苗仅3棵，所以5代以内的畸形苗的几率远低于1％。
实施例2
在本实施例中，提供了一种北沙参一次成苗的组培快繁方法，包括如下步骤：
1)北沙参种子灭菌处理：挑选低温沙藏即将发芽的北沙参果实50粒，将其果翅剥离，置于自来水下小水流冲洗20分钟，75％酒精浸泡40秒，无菌水冲洗1次后，再用0.15％的升汞浸泡5分钟，期间不断摇动，使其均匀灭菌，用无菌水冲洗4次，取出种子待用。
2)增殖培养：将灭好菌的北沙参种子接种至添加有6-ba(1mg/l)、naa(0.1mg/l)、麦芽糖(40g/l)和琼脂(5g/l)的ms培养基(ph值为5.8)上，培养基体积约为接种瓶体积的1/3，放在温度为27℃、12h黑暗 12小时光照强度为1600lx的培养室里，进行不定芽的诱导和培养。
培养15天后，北沙参种子逐渐产生不定芽，继续培养1个月，北沙参不定芽发育成苗，同时继续形成新的不定芽，增殖倍数可达到8以上。
3)穴盘炼苗：挑选株高4-5cm高、具有3片以上基生叶的健壮北沙参苗，在砂质土壤中进行穴盘炼苗24天，同时保湿。在此过程中，北沙参苗长出新叶和根，可进行移栽定植。
4)移栽定植：将长出新叶的北沙参苗定植于大田，初期适当遮阴保湿。
5)循环增殖培养：在挑选后，继续用步骤2)中增殖培养挑选后剩下的不定芽和北沙参苗，使其继续产生不定芽、不定芽生长成北沙参苗，并进行步骤3)和步骤4)，从而利用同一种培养基循环增殖。
本实施例结果：统计方法同实施例1。结果表明，本实施例中初培养得到第一批苗的时间为45天，继代周期30天，增殖倍数8-9，成苗率大于90％，五代以内的畸形苗率远低于1％。
实施例3
在本实施例中，提供了一种北沙参一次成苗的组培快繁方法，包括如下步骤：
1)北沙参种子灭菌处理：挑选低温沙藏即将发芽的北沙参果实50粒，将其果翅剥离，置于自来水下小水流冲洗冲洗20分钟，75％酒精浸泡10秒，无菌水冲洗1次后，再用0.15％的升汞浸泡5分钟，期间不断摇动，使其均匀灭菌，用无菌水冲洗5次，取出种子待用。
2)增殖培养：将灭好菌的北沙参种子接种至添加有激动素kt(3mg/l)、iaa(0.5mg/l)、葡萄糖(30g/l)和琼脂(8g/l)的ms培养基(ph值为5.8)上，培养基体积约为接种瓶体积的1/3，放在温度为22℃、12h黑暗 12小时光照强度为2400lx的培养室里，进行不定芽的诱导和培养。
培养10天后，北沙参种子逐渐产生不定芽，继续培养1个月，北沙参不定芽发育成苗，同时继续形成新的不定芽，增殖倍数可达到8以上。
3)穴盘炼苗：挑选株高4-5cm高、具有3片以上基生叶的健壮北沙参苗，在砂质土壤中进行穴盘炼苗20天，同时保湿。在此过程中，北沙参苗长出新叶和根，可进行移栽定植。
4)移栽定植：将长出新叶的北沙参苗定植于大田，初期遮阴保湿。
5)循环增殖培养：在挑选后，继续用步骤2)中增殖培养挑选后剩下的不定芽和北沙参苗，使其继续产生不定芽、不定芽生长成北沙参苗，并进行步骤3)和步骤4)，从而利用同一种培养基循环增殖。
本实施例结果：统计方法同实施例1。结果表明，本实施例中初培养得到第一批苗的时间为40天，继代周期30天，增殖倍数8-9，成苗率85％，五代以内的畸形苗率远低于1％。
实施例4
在本实施例中，提供了一种北沙参一次成苗的组培快繁方法，包括如下步骤：
1)北沙参种子灭菌处理：挑选低温沙藏即将发芽的北沙参果实50粒，将其果翅剥离，置于自来水下小水流冲洗40分钟，75％酒精浸泡35秒，无菌水冲洗1次后，再用0.15％的升汞浸泡8分钟，期间不断摇动，使其均匀灭菌，用无菌水冲洗5次，取出种子待用。
2)增殖培养：将灭好菌的北沙参种子接种至添加有激动素kt(1mg/l)、iaa(0.2mg/l)、蔗糖(30g/l)和琼脂(8g/l)的ms培养基(ph值为5.8)上，培养基体积约为接种瓶体积的1/3，放在温度为25℃、12h黑暗 12小时光照强度为2000lx的培养室里，进行不定芽的诱导和培养。
培养15天后，北沙参种子逐渐产生不定芽，继续培养1个月，北沙参不定芽发育成苗，同时继续形成新的不定芽，增殖倍数可达到6以上。
3)穴盘炼苗：挑选株高4-5cm高、具有3片以上基生叶的健壮北沙参苗，在砂质土壤中进行穴盘炼苗18天，同时保湿。在此过程中，北沙参苗长出新叶和根，可进行移栽定植。
4)移栽定植：将长出新叶的北沙参苗定植于大田，初期遮阴保湿。
5)循环增殖培养：在挑选后，继续用步骤2)中增殖培养挑选后剩下的不定芽和北沙参苗，使其继续产生不定芽、不定芽生长成北沙参苗，并进行步骤3)和步骤4)，从而利用同一种培养基循环增殖。
本实施例结果：统计方法同实施例1。结果表明，本实施例中初培养得到第一批苗的时间为45天，继代周期30天，增殖倍数6-7，成苗率83％，五代以内的畸形苗率远低于1％。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,可以利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
1.北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将北沙参的种子进行灭菌处理；
2)将灭菌的种子接种到添加有细胞分裂素、生长素、碳源和琼脂的ms培养基上并培养，诱导产生不定芽和北沙参苗；
3)选择健壮的北沙参苗进行穴盘炼苗，并保湿，使北沙参苗长出新叶和根；和
4)移栽定植长出新叶和根的北沙参苗。
2.根据权利要求1所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，步骤1)具体包括，将所述北沙参的种子用水冲洗15-45分钟，75％酒精浸泡10-40秒，无菌水冲洗1-2次，0.05-0.15％的升汞浸泡4-12分钟，再用无菌水冲洗3-7次。
3.根据权利要求1所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，在所述ms培养基中，所述细胞分裂素、生长素、碳源、琼脂的浓度分别为1-3mg/l、0.1-0.5mg/l、20-40g/l、5-8g/l。
4.根据权利要求据权利要求3所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，所述细胞分裂素选自激动素(kt)、6-苄基氨基嘌呤(6-ba)中的一种或两种。
5.根据权利要求据权利要求3所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，所述生长素选自吲哚乙酸(iaa)、萘乙酸(naa)中的一种或两种。
6.根据权利要求3所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，在步骤2)中培养在22-28℃、12h黑暗 12h光照的条件下进行，且光照强度为1500-2500lx。
7.根据权利要求1所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，在步骤4)中所述健壮的北沙参苗为株高4-5cm、具有3片以上基生叶的植株。
8.根据权利要求1所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，在步骤3)中，穴盘炼苗持续10-25天。
9.根据权利要求1-9中任一项所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，还包括循环增殖选择后剩余的不定芽和北沙参苗，并重复步骤3)和步骤4)。
10.根据权利要求9所述的北沙参一次成苗的组培快繁方法，其特征在于，所述循环增殖持续至少5代。
技术总结