本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种非糖尿病基础上的重度非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型及其构建方法和用途。
背景技术：
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)是为临床常见的肝脏疾病之一，其中非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，nash)是非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliver，nafl)向非酒精性脂肪性肝硬化转化过程中一个非常重要的环节，是隐源性肝硬化的重要原因之一。研究表明，nash的预后不佳，约50%的nash患者随访6年后可进展成肝纤维化，10%-15%在10-20年内可进展成肝硬化，而9%-26%在随访的4-10年内可因终末期肝病死亡。因此，研究nash的防治策略是目前国内外肝病界的热点之一。
nash的发病机制至今尚不完全清楚，需要通过大量的动物实验开展深入的研究.然而，目前国内外的nash动物模型杂乱不一，缺少统一的标准，在一定程度上限制了nash病理机制及治疗药物的深入研究。已有的nash动物模型按其构建方法的不同分为病理性饮食诱导模型、化学毒物诱导小鼠模型、物理损伤小鼠模型、基因突变特殊品系及复合因素诱导的脂肪肝模型等，这些方法均存在着一些难以解决的问题。病理性饮食诱导模型耗时长（多是16-32周），同时病变不一致，不稳定，特别是肝纤维化仅仅局限于轻度或极轻度，不能真实的再现人类的nash，特别是饮食和肥胖所致的非糖尿病性nash疾病。潘磊等（中国组织工程研究，第20卷第40期，2016.09.30）采用高脂饲料喂养，构建了c57bl/6非酒精性脂肪性肝病小鼠模型，于第8周形成了非酒精性脂肪肝模型。但是该模型20周内无法产生纤维化，纤维化发生多在30周以后，试验周期过长，不经济适用，模型也不稳定。
化学毒物诱导模型虽然可以诱导产生肝纤维化或肝硬化，但所需时间长，纤维化和肝硬化的机理并非nash肝纤维化的公认机理，大大增加了研究时间、经费和难度。同时，化学诱导与人类实际的nash的发病机理相差较远，不具备nash研究和新药开发所需的基本模型参数，常需结合高脂饮食构建复合型模型。fujiim（fujiim，shibazakiy，wakamatsuk，etal．amurinemodelfornonalcoholicsteatohepatititsshoeingevidenceofassociationbetweendiabetesandhepatocellularcarcinoma［j］．medmolmorphol，2013，46:141-152．）等通过新生小鼠腹腔注射stz，4周龄时hfd诱导构建模型，2周可观察到单纯性脂肪变性，4周肝脏出现炎症与气球样变，4～8周观察到进行性的纤维化发生。但是，该模型nash仅仅处于轻度或早期，伴有及轻的肝纤维化，仍不具备典型的nash的基本病变，特别是显著性肝纤维化，基本不适用于中度到重度nash的实验研究。二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，den)具有较强的肝毒性，可导致肝细胞dna损伤突变从而诱发肝癌，与人类肝癌发病过程相近，常用作大小鼠肝细胞癌模型构建的诱导剂，多用于nafld中肝细胞癌发生发展的研究。thompson等（thompsonkj，swanrz，wallingtl，etal．obesity，butnotethanol，promotestumorincidenceandprogressioninamousemodelofhepatocellularcarcinomainvivo［j］．surgendosc，2013，27:2782-2791．）通过一次性给21～25日龄小鼠腹腔内注射den，喂养hfd42周，出现nash表型并伴有肝细胞癌发生。den用来诱导小鼠和大鼠肝癌的试剂所需时间很长，多超过36周，并且nash病理改变不够明显。
目前应用的nash模型都不具备中到重度的肝纤维化特征。然而，药物研发以及临床研究中更需要的是模拟人类的nash伴有中到重度肝纤维化，特别是非糖尿病基础上的nash动物疾病模型，因此构建具有重度的肝纤维化特征的非糖尿病基础上的非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型是科研者们的研究方向。
技术实现要素：
发明针对现有技术不足，鉴于以上所述现有模型的缺点，提供一种非糖尿病基础上的重度非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型的构建方法，并进一步提供由所述方法构建获得的大鼠模型及其用途。本发明构建得到的非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型具有重度nash伴有中度慢性肝纤维化特点，诱导的动物肝组织呈现重度脂肪变、重度炎症病变以及加重肝细胞凋亡的气球样变，产生重度nash的基本病理过程，特别是伴随显著的肝纤维化的病理改变。
本发明具体技术方案如下：
一种非糖尿病基础上的重度非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型的构建方法，对初生大鼠给与单次二乙基亚硝胺（den）注射，出生4周后（母乳饲养结束）给予饲喂高脂高胆固醇胆盐饲料，连续8-12周，构建得到重度及伴有中度慢性肝纤维化的非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型。
上述构建方法，所述大鼠为雌性或雄性的sd大鼠或waster大鼠。
上述的构建方法，注射方式为皮下注射或腹腔注射。
上述构建方法，优选二乙基亚硝胺皮下注射剂量为30-50mg/kg。优选高脂高胆固醇胆盐饲料的配比为：60%高脂 1.25%胆固醇 05%胆盐。
上述构建方法，优选高脂高胆固醇胆盐饲料自由饮食，饲喂时间为8周。
本发明另一目的在于提供一种非糖尿病基础上的重度非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型，采用本发明所述方法构建而成。本发明所述的模型伴有中度慢性肝纤维化的非酒精性慢性脂肪性肝炎病理特征。
本发明的另一目的在于提供本发明所述的非糖尿病基础上的重度非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型在筛选预防或治疗非酒精性慢性脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化或肝癌的药物中的应用以及作为动物模型在慢性脂肪肝，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，肝细胞性肝癌，代谢性疾病，糖尿病，糖尿病并发症的研究中的应用。
本发明有益效果：本发明所述方法构建得到非糖尿病基础上的非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型具有重度nash伴有中到重度慢性肝纤维化特点，诱导的动物肝组织呈现重度脂肪变、重度炎症病变以及加重肝细胞凋亡的气球样变，产生重度nash的基本病理过程，特别是伴随显著的肝纤维化的病理改变，与现有技术的小动物nash模型相比具有显著优势，符合目前人类nash和肝纤维化的发病基本原理，能真实模拟并接近人类非糖尿病性nash的病理过程以及临床的病期过程。模型成功率百分之百，稳定性好，无死亡率。填补了该领域的nash物模型的空白，为人类nash和肝纤维化的研究，特别是重度nash伴有中度肝纤维化的研究，以及新药研发提供了不可缺少的动物模型。
附图说明
图1为本发明实施例各试验组大鼠模型肝脏。
图2为本发明实施例各试验组肝脏重量变化。
图3为各实验组大鼠空腹血糖变化。
图4为本发明实施例各试验组血清alt和ast变化。
图5为本发明实施例各试验组肝脏nas评分。
图6为本发明实施例各试验组肝脏病理学变化h&e染色。
图7为本发明实施例各试验组肝纤维化定量分析。
图8为本发明实施例各试验组肝脏病理学变化天狼星红染色结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1非糖尿病基础上的重度非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型的制备
以sd雄性大鼠为例，提供一种制作非糖尿病基础上的重度非酒精性脂肪性肝炎（nash）伴有中度肝纤维化的动物模型的方法，包括步骤为：
选用6只sd雌性孕鼠，12h光照和黑夜循环，温度22℃±2℃，湿度50%-60%。
（1）雄性幼鼠5只不做任何处理，正常母乳饲养。
（2）雄性幼鼠5只出生后2周给与单次生理盐水皮下注射。
（3）其它雄性幼鼠出生后2周给与单次den皮下注射（50mg/kg）。
（4）母乳饲养结束后（生后4周）雄性幼鼠分笼、分组：
naive-12wk组：未经den注射的雄性动物，正常维持饲料饲养8周；
生理盐水组（模型组）：生理盐水注射动物（n=5），开始高脂高胆固醇加胆盐饲料饲养12周；
den-8wk组：den注射动物（n=5），开始高脂高胆固醇加胆盐饲料饲养8周；
den-12wk组：den注射动物（n=5），开始高脂高胆固醇加胆盐饲料饲养12周。
（4）实验终点：动物分别在设计的实验终点进行安乐死。采集外周血，分离血清检测nash相关肝功能指标。肝脏组织经10%中性福尔马林固定，行肝脏病理分析。
高脂高胆固醇饲料胆盐饲料配方指定供应商提供饲料，为spf级饲料，-20℃低温保存。
实验结果
1.各实验组大鼠肝脏如图1所示，肝脏重量变化图2所示，结果显示单纯高脂高胆固醇胆盐饲料饲养可显著性引起肝肿大，脂肪肝样的肝表面土黄色改变，den注射后高脂高胆固醇胆盐饲料饲养不仅仅导致肝脂肪变，同时可见肝脏进一步增大，肝表面粗糙，肝纤维化的改变，表明den加高脂高胆固醇胆盐饲料饲养显著性加重肝损伤，进入重度nash的肝脏病理改变。
2.各实验组大鼠空腹血糖变化如图3所示，结果显示模型建立12周未改变动物血糖，实现了非糖尿病性的nash模型。
3.各实验组大鼠血清alt和ast变化如图4所示，结果显示模型动物，不仅是单纯的高脂高胆固醇胆盐饲养还是den加高脂高胆固醇胆盐饲养都显著性升高血中的alt和ast，并且，den的注射造成更加显著的升高，表明den结合高脂高胆固醇胆盐饲料会造成肝细胞显著性损伤，加剧nash的病理进程。
4.各实验组大鼠肝脏nas评分结果如图5所示，结果显示模型动物均出现显著性的重度nas病理改变，nas评分大于6分，den注射和非注射不改变nas的评分。结果表明den结合高脂高胆固醇胆盐饲料会造成肝脏重度nash病理改变。
5.各实验组大鼠肝脏病理学变化h&e染色如图6所示，结果显示nas的三个病理改变，即脂肪变，炎细胞浸润和肝细胞气球样变，表明所有模型动物均进入显著性nash肝脏的病理进程。
6.各实验组大鼠肝纤维化定量分析结果如图7所示，所有模型动物与正常动物比较均出现不同程度的肝纤维化，但是单纯的高脂高胆固醇胆盐饲养的动物的肝纤维化程度较轻，仅呈现轻度的病理性纤维化（小于1.2%），并且纤维化多集中在汇管区。而接受den注射的动物则呈现更为严重的病理性肝纤维化，分布在汇管区，肝细胞索之间，形成桥接性纤维化结构。8周的高脂高胆固醇胆盐饲料饲养后纤维化超过1.5%。
7.各实验组大鼠肝脏病理学变化天狼星红染色结果如图8所示，结果显示模型动物肝纤维化的结构分布和量的分布，再现了nash的肝纤维化分布在肝细胞索之间，呈现纤细沿著肝窦间隙分布的病理特征，其中，单纯的高脂高胆固醇胆盐饲养的动物的肝纤维化程度较轻，局限在汇管区周围，而接受den注射的动物肝纤维化程度更为显著，纤维化分布在汇管区，中央静脉周围和肝细胞索周围，特别是可见早起的桥接性纤维化，显示肝纤维化进入早期肝硬化阶段。
总结：
本发明对幼年大鼠给予单次den皮下注射，结束母乳喂养后（生后四周）开始饲喂高脂高胆固醇加胆盐饲料，连续8-12周，构建非糖尿病性非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型具有重度nash伴有中度慢性肝纤维化，符合目前人类nash和肝纤维化的发病基本原理，能真实模拟并接近人类非糖尿病性nash的病理过程。模型成功率百分之百，稳定性好，无死亡率。填补了该领域的nash物模型的空白，为人类nash和肝纤维化的研究，特别是重度nash伴有中度肝纤维化的研究，以及新药研发提供了不可缺少的动物模型。
1.一种非糖尿病基础上的重度非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型的构建方法，其特征在于对初生2周的大鼠单次注射二乙基亚硝胺，出生4周后给予饲喂高脂高胆固醇胆盐饲料，连续8-12周，构建得到重度及伴有中度慢性肝纤维化的非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述大鼠为雌性或雄性的sd大鼠或waster大鼠。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于注射方式为皮下注射或腹腔注射。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述二乙基亚硝胺注射剂量为30-50mg/kg。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述高脂高胆固醇胆盐饲料的配比为：60%高脂 1.25%胆固醇 05%胆盐。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述高脂高胆固醇胆盐饲料自由饮食，饲喂时间为8周。
7.一种非糖尿病基础上的重度非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型，其特征在于采用权利要求1-6任一项权利要求所述方法构建而成，所述模型伴有重度及伴有中度慢性肝纤维化的非酒精性慢性脂肪性肝炎病理特征。
8.如权利要求7所述的非糖尿病基础上的重度非酒精性慢性脂肪性肝炎大鼠模型在筛选预防或治疗非酒精性慢性脂肪性肝炎，特别是那些非糖尿病性的非酒精性慢性脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化或肝癌的药物中的应用以及作为动物模型在慢性脂肪肝，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，肝细胞性肝癌，代谢性疾病，糖尿病，糖尿病并发症的研究中的应用。
技术总结