本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种糖尿病伴随重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型及其构建方法和用途。
背景技术：
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)是为临床常见的肝脏疾病之一，其中非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，nash)是非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliver，nafl)向非酒精性脂肪性肝硬化转化过程中一个非常重要的环节，是隐源性肝硬化的重要原因之一。研究表明，nash的预后不佳，约50%的nash患者随访6年后可进展成肝纤维化，10%-15%在10-20年内可进展成肝硬化，而9%-26%在随访的4-10年内可因终末期肝病死亡。因此，研究nash的防治策略是目前国内外肝病界的热点之一。
nash的发病机制至今尚不完全清楚，需要通过大量的动物实验开展深入的研究.然而，目前国内外的nash动物模型杂乱不一，缺少统一的标准，在一定程度上限制了nash病理机制及治疗药物的深入研究。已有的用于糖尿病伴有nash、肝纤维化、肝硬化以及肝癌动物体内实验的小鼠模型按其构建方法的不同分为转基因诱导小鼠模型和化学损伤诱导的小鼠模型，这些方法均存在着一些问题，具体来说：(1)转基因诱导小鼠糖尿病模型伴有nash成本高，周期长（20周或更长），模型不稳定，特别是肝纤维化及轻，不能够再现重度nash伴有显著性的肝纤维化（中度或重度），与人类实际的nash的发病机理相差甚远，缺乏nash研究和新药开发所需的模型参数。(2)化学损伤诱导的小鼠模型多用stz损伤动物的胰岛造成糖尿病，包括幼鼠和成年鼠，追加高脂饲料喂养。模型成本周期和稳定性相对转基因诱导的模型更为有效。fujiim（fujiim，shibazakiy，wakamatsuk，etal．amurinemodelfornonalcoholicsteatohepatititsshoeingevidenceofassociationbetweendiabetesandhepatocellularcarcinoma［j］．medmolmorphol，2013，46:141-152．）等通过新生小鼠腹腔注射stz，4周龄时hfd诱导构建模型，2周可观察到单纯性脂肪变性，4周肝脏出现炎症与气球样变，4～8周观察到进行性的纤维化发生。但是，该模型nash仅仅处于轻度或早期，伴有及轻的肝纤维化，仍不具备典型的nash的基本病变，特别是显著性肝纤维化，基本不适用于中度到重度nash的实验研究。
技术实现要素：
本发明针对现有技术不足，鉴于以上所述现有模型的缺点，提供了一种模拟人类糖尿病伴随重度nash的小鼠模型的构建方法及其用途，并进一步提供由所述方法构建获得的小鼠模型及其用途。本发明所构建的动物模型可用于慢性脂肪肝，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，肝细胞性肝癌，代谢性疾病，糖尿病，糖尿病并发症的相关机制的体内实验，新药研发，在糖尿病伴有非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝纤维化和肝癌发病机制的研究和药物研发中，具有极高的应用价值。
本发明具体技术方案如下：
一种糖尿病伴随重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建方法，对新生小鼠初生后24小时一次性注射链脲佐菌素（stz），初生后2周一次性注射二乙基亚硝胺(den)，初生后4周高脂高胆固醇胆盐饲料饲育8-12周构建得到糖尿病基础上的重度并伴有肝纤维化的非酒精性慢性脂肪性肝炎小鼠模型。
上述的构建方法，所述小鼠为雌性或雄性的c57bl/6小鼠。
上述的构建方法，注射方式为皮下注射或腹腔注射。
上述的构建方法，所述链脲佐菌素注射剂量为每只动物100-400微克，二乙基亚硝胺皮下注射剂量为30-50mg/kg。优选所述链脲佐菌素注射剂量为每只动物200微克，二乙基亚硝胺皮下注射剂量为30mg/kg。
上述的构建方法，高脂高胆固醇胆盐饲料配方为60%高脂 1.25%胆固醇 05%胆盐
上述构建方法，优选高脂高胆固醇胆盐饲料为每日动物自由采食，饲喂时间为8周。
本发明另一目的在于提供一种糖尿病伴随重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型，采用本发明所述方法构建而成。本发明所述的模型具有糖尿病以及重度并伴有肝纤维化的非酒精性慢性脂肪性肝炎病理特征。
本发明的另一目的在于提供本发明所述的小鼠模型在筛选预防或治疗糖尿病伴有非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝纤维化和肝癌药物中的应用以及作为动物模型在慢性脂肪肝，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，肝细胞性肝癌，代谢性疾病，糖尿病，糖尿病并发症的研究中的应用。
本发明有益效果：本发明突破了现有技术针对糖尿病基础上重度nash造模的困境，结合使用链脲佐菌素、二乙基亚硝胺以及高脂高胆固醇胆盐饲料成功构建了糖尿病伴随重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型，该模型在糖尿病基础具备典型的重度nash的病变，特别是显著性肝纤维化，在糖尿病伴有非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝纤维化和肝癌发病机制的研究和药物研发中，具有极高的应用价值。
附图说明
图1为本发明各实验组小鼠实验终点空腹血糖。
图2为本发明各实验组实验终点小鼠肝脏。
图3为本发明实施例各实验组实验终点小鼠肝脏重量变化。
图4为本发明实施例各实验组小鼠血清alt和ast变化。
图5为本发明实施例各实验组小鼠肝脏nas评分。
图6为本发明实施例各实验组小鼠肝脏病理学变化h&e染色。
图7为本发明实施例各实验组小鼠肝纤维化定量分析。
图8为本发明实施例各实验组小鼠肝脏病理学变化天狼星红染色结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1糖尿病基础上的重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建
选用c57bl/6雌性孕鼠，12h光照和黑夜循环，温度22℃±2℃，湿度50%-60%。
（1）雄性仔鼠出生后5只不做任何处理，正常饲养。
（2）雄性仔鼠出生后24小时背部皮下一次性注射stz(每只动物200微克)，共17只。
（2）雄性仔鼠出生后2周背部皮下一次性注射den(7只30mg/kg，5只50mg/kg)。
（3）雄性仔鼠哺乳期4周。哺乳期间母鼠正常标准饲料饲育。
（4）哺乳期4周结束后，按照实验方案将动物分组如下：
naive-8wk组：正常雄鼠（n=5），普通饲料饲养；
stz-8wk组：单纯stz注射雌鼠（n=5），高脂高胆固醇胆盐饲料饲育8周；
den-l-8wk组：stz注射 den注射（30mg/kg）雌鼠（n=7），高脂高胆固醇胆盐饲料饲育8周；
den-h-8wk组：stz注射 den注射（50mg/kg）雌鼠（n=5），高脂高胆固醇胆盐饲料饲育8周。
饲料均由实验动物饲料有限公司加工制作，为spf级饲料，-20℃低温保存。
（5）实验终点小鼠执行安乐死，分别检测动物血生化，肝功以及肝脏病理，鉴定nash的病理变化。
实验结果
1.各实验组小鼠实验终点空腹血糖变化如图1所示，结果显示stz-8wk组、den-l-8wk组和den-h-8wk组小鼠空腹血糖值升高，与正常组相比有极显著性差异，成功建立重度糖尿病动物。
2.各实验组小鼠肝脏如图2所示，肝脏重量变化图3所示，结果显示模型动物的肝脏显著增加，肝脏呈黄白色，脂肪肝的外观，表明所有模型动物都呈现了nas肝脏的改变，并且接受den注射的动物肝脏较stz单独注射的动物肝脏显著增大，提示nas病变更加严重。
3.各实验组小鼠血清alt和ast变化如图4所示，结果显示模型动物的alt和ast显着升高，表明模型动物的肝脏损伤程度。同时，高剂量den注射的动物alt和ast显著高于stz单独注射的动物，提示nas的严重程度更高。
4.各实验组小鼠肝脏nas评分结果如图5所示，结果显示正常对照动物的nas评分为0分，所有模型动物的nsh评分均超过6分，表明模型动物均进入nash阶段，单独stz注射的动物与stz den注射的动物在nas评分上无显著的差异。
5.各实验组小鼠肝脏病理学变化h&e染色如图6所示，结果显示nas的三个病理改变，即脂肪变，炎细胞浸润和肝细胞气球样变，表明所有模型动物均进入显著性nash肝脏的病理进程。
6.各实验组小鼠肝纤维化定量分析结果如图7所示，结果显示所有模型动物与正常动物比较均出现不同程度的肝纤维化，但是stz单独注射的动物的肝纤维化程度较轻，仅达到轻度病理性纤维化（小于1.5%），而进一步接受den注射的动物较stz单独注射的动物呈现更为严重的肝纤维化，达到了显著的病理性纤维化≈2%），特别是高剂量den注射导致超过3%的肝脏病理性纤维化。
7.各实验组小鼠肝脏病理学变化天狼星红染色结果如图8所示，结果显示模型动物肝纤维化的结构分布和量的分布，再现了nash的肝纤维化分布在肝细胞索之间，呈现纤细沿著肝窦间隙分布的病理特征，其中，stz单独注射的动物的肝纤维化程度较轻，而进一步接受den注射的动物较stz单独注射的动物肝纤维化程度更为显著。
结论
本发明成功构建了糖尿病伴随重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型，结合使用链脲佐菌素、二乙基亚硝胺以及高脂高胆固醇胆盐饲料成功构建了糖尿病伴随重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型，与单纯stz诱导的肝脏nash病变相比较，den的加入成功的诱导nas肝脏出现重度肝纤维化，该模型在糖尿病基础具备典型的重度nash的病变。
1.一种糖尿病伴随重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建方法，其特征在于对新生小鼠初生后24小时一次性注射链脲佐菌素，初生后2周一次性注射二乙基亚硝胺，初生后4周使用高脂高胆固醇胆盐饲料饲育8-12周构建得到糖尿病基础上的重度并伴有肝纤维化的非酒精性慢性脂肪性肝炎小鼠模型。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述小鼠为雌性或雄性的c57bl/6小鼠。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于注射方式为皮下注射或腹腔注射。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述链脲佐菌素注射剂量为每只动物100-400微克，二乙基亚硝胺皮下注射剂量为30-50mg/kg。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述链脲佐菌素注射剂量为每只动物200微克，二乙基亚硝胺皮下注射剂量为30mg/kg。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述高脂高胆固醇胆盐饲料的配比为：60%高脂 1.25%胆固醇 05%胆盐。
7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述高脂高胆固醇胆盐饲料饲喂时间为8周。
8.一种糖尿病伴随重度非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型，其特征在于采用权利要求1-7任一项权利要求所述方法构建而成，所述模型具有糖尿病以及重度并伴有肝纤维化的非酒精性慢性脂肪性肝炎病理特征。
9.如权利要求8所述的小鼠模型在筛选预防或治疗糖尿病伴随非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝癌药物中的应用以及作为动物模型在慢性脂肪肝，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，肝细胞性肝癌，代谢性疾病，糖尿病，糖尿病并发症的研究中的应用。
技术总结