本发明属于中药安全评价
技术领域：
，具体涉及一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法。
背景技术：
：药食同源中药越来越受到人们的亲睐，是进行食品或保健品开发的重要原料之一，而且作为防治疾病的特殊物质，老百姓对药食同源中药安全性的了解日趋迫切。药食同源中药及其制剂在中外的医疗和保健上的应用愈发广泛,随着大众的医药安全意识增强和监测机制的不断完善，药食同源中药可能的安全性问题日渐突显,成为影响中医药国际化、现代化的关键因素之一。中药历来被贴有“效果好、副作用小”的标签,具有“多成分、多靶点”的优势。但以往较长的一段时期内,人们普遍更注意中药的有效性,而对其安全性重视不足。我国传统的药食同源思想是食品保健思想的反映，包含着中医药学中的安全、营养、保健和治疗作用。《本草纲目》记录了较多的中药在民间也是常见的食物。药食同源中药在用法与用量恰当的情况下不会造成明显的毒性或不良反应。中医以四气五味代表各种中药及其特点，认为各种中药的摄取不能有偏；如果长期偏食，就有可能影响机体功能甚至产生疾病，如果食用不当反而给身体带来不利影响。药食同源的中草药按传统的急性毒性实验的结果，其安全性都比较高，接下来的安全评价实验中很重要的实验是三十天喂养试验，是一个承上启下的实验，这个实验可以给后续实验的进行提供剂量选择的参考和重点靶器官的筛选观察提供思路，而传统的三十天喂养试验采用的是正常健康啮齿类动物，但是中药在这个阶段的实验中，正常动物一般无法表现出毒性反应。药食同源中药具有很多的分类，其中具有补益作用的中药和复方是使用很多的一种，如何能科学准确地评价其毒性作用和药效，针对中药药效种类选择动物模型是做好评价的关键。中药虽然经过了几千年的传承与应用，多数中药进行组方和配伍应用，以及炮制处理，毒性中药或毒性减少或毒性消失，但是对于中药的毒性现代科学的理解很多还说不清，中药的毒性亟待按现代评价方法进一步评价，但现有的经典的毒理学的实验以及评价体系难以客观做出评价。目前还没有区分中药药效功能基础上的毒性评价方法和体系。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：针对现有的中药评价体系和方法的缺陷与不足，提供一种对补益类中药进行安全评价的实验模型和评价方法。本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。首先，本发明公开了一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法。该构建方法使用断乳后一周的大鼠或小鼠，以低蛋白、低摄入量的饲喂投放方式进行喂养造模，同时给予连续三十天受试中药的饲喂。进一步地，所述的受试中药为补益类中药。进一步地，所述的低摄入量为动物正常喂养量的30-80％。优选地，所述的低摄入量为动物正常喂养量的50％。进一步地，所述的低蛋白为低蛋白全价饲料；所述的低蛋白全价饲料为10％纯植物蛋白的饲料。更进一步地，所述的10％纯植物蛋白的饲料，以质量百分比计，具体配方为：玉米50-60％、小麦30-40％、蜜糖酵母2-3％、磷酸氢钙1.5-2.5％、石粉0.8-1.2％、氯化胆碱0.15-0.25％、生长预粉料1％、食盐0.25-0.35％、油2-3％、豆粕0％、鱼粉0％、酪蛋白0％、控制粗蛋白含量为9-12％。优选地，所述的10％纯植物蛋白的饲料，以质量百分比计，具体配方为：玉米55％、小麦35.5％、蜜糖酵母2.5％、磷酸氢钙2％、石粉1％、氯化胆碱0.2％、生长预粉料1％、食盐0.3％、油2.5％、豆粕0％、鱼粉0％、酪蛋白0％、控制粗蛋白含量为10-11％。优选地，所述的生长预粉料为国家标准实验动物用的预粉料，内含物质元素以质量百分比计，包含有铜6％、铁6％、锰1.3％、锌4.2％、硒0.3％、镁1.5％、碘0.13％、钴0.02％、复合维生素0.4％。其次，本发明公开了上述构建方法所获得的实验模型的一种应用。该实验模型用于补益类中药进行安全评价。进一步地，所述的安全评价具体为：通过对断乳后一周的大鼠或小鼠喂以低摄入量的低蛋白饲料的方式造成营养不良或脾虚的模型，同时连续三十天灌胃受试的补益类中药，三十天后采集动物的血液和组织，进行分析，并按bdi-gs的评价体系评价补益类中药对主要脏器的影响。有益效果：(1)、本发明所公开的对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法，填补了补益类中药的三十天安全评价实验模型的空白，也可用于补脾类中药的药效学研究,对于科学评价这类中药和复方具有重要意义。(2)本发明所构建的补益类中药安全评价实验模型,能够真实反映出动物出现脾虚证,在此基础上可以观察补益类中药或复方的补脾作用的药效评价。附图说明图1为补中益气丸不同剂量低蛋白喂养雄性小鼠体重变化趋势图；图2为补中益气丸不同剂量低蛋白喂养雌性小鼠体重变化趋势图；图3为补中益气丸对低蛋白喂养雄性小鼠血常规的影响；图4为补中益气丸对低蛋白喂养雌性小鼠血常规的影响；图5为补中益气丸对低蛋白喂养雄性小鼠血液中肝功能的影响；图6为补中益气丸对低蛋白喂养雌性小鼠血液中肝功能的影响；图7为补中益气丸对低蛋白喂养雄性小鼠的肾功能影响；图8为补中益气丸对低蛋白喂养雌性小鼠的肾功能影响；图9为补中益气丸对低蛋白喂养雄性小鼠脏器的影响；图10为补中益气丸对低蛋白喂养雌性小鼠脏器的影响；图11为江香薷不同剂量低蛋白喂养雄性小鼠体重变化趋势图；图12为江香薷不同剂量低蛋白喂养雌性小鼠体重变化趋势图；图13为江香薷对低蛋白喂养雄性小鼠血常规的影响；图14为江香薷对低蛋白喂养雌性小鼠血常规的影响；图15为江香薷对低蛋白喂养雄性小鼠血液中肝功能的影响；图16为江香薷对低蛋白喂养雌性小鼠血液中肝功能的影响；图17为江香薷对低蛋白喂养雄性小鼠的肾功能影响；图18为江香薷对低蛋白喂养雌性小鼠的肾功能影响；图19为江香薷对低蛋白喂养雄性小鼠脏器的影响；图20为江香薷对低蛋白喂养雌性小鼠脏器的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。实施例1：10％纯植物蛋白饲料采食量的确定选择断乳一周的小鼠进行试验，实验为使用10％和30％的蛋白含量的饲料投喂,发现短期一个月内的体重变化不大,见下表1与表2。表1低蛋白和高蛋白饮食1月雄性昆明鼠体重变化表2低蛋白和高蛋白饮食1月雌性昆明鼠体重变化进一步选择10％蛋白的饲料按30％、50％和80％的投喂量喂养小鼠30天，连续检测实验小鼠的体重变化，综合小鼠的临床表现，发现50％的投喂量效果比较好，体重结果见下表3与表4。表3低蛋白饲料30％、50％、80％投喂量饮食28天雄性昆明鼠体重变化组别0d4d8d12d16d20d24d28d30％18.117.716.715.814.614.714.213.850％18.118.418.619.119.420.120.521.280％18.119.521.423.424.326.527.329.1表4低蛋白饲料30％、50％、80％投喂量饮食28天雌性昆明鼠体重变化组别0d4d8d12d16d20d24d28d30％17.915.012.612.511.711.211.010.750％17.718.218.518.719.219.520.120.780％17.521.023.123.726.127.527.828.6实施例2:补中益气丸的30天喂养毒性试验及评价1.材料与方法1.1实验动物4周龄生长期km小鼠雌雄各90只，由江西中医药大学实验动物科技中心提供，合格证号：scxk(赣)2018-0003。实验小鼠饲养在江西中医药大学实验动物科技中心spf级屏障系统内，环境温度为20℃～23℃、湿度45％～55％，使用许可号为syxk(赣)2018-0004。1.2试剂与仪器0.9％氯化钠溶液，全自动生化仪(贝克曼au480)、酶标仪(thermo)、显微镜(ix37生物显微镜)、电子天平(auy120岛津分析天平)、alt、ast、alp、ggt、alb、tb、db、tp、cr、bun、ua含量检测试剂盒(上海科华生物技术有限公司提供)。1.3饲料选择造模饲料为低蛋白饲料，饲料配方为玉米55％，小麦35.5％，蜜糖酵母2.5％，磷酸氢钙2％，石粉1％，氯化胆碱0.2％，生长预粉料1％，食盐0.3％，油2.5％，豆粕0％，鱼粉0％，酪蛋白0％，粗蛋白为10.7％。正常饲料为万千佳兴饲料提供的标准饲料，蛋白含量为20％。1.4实验动物分组与处理建立低营养模型鼠，通过限制采食低蛋白量的饲料进行造模。在此基础上给予模型对照组(水)、补中益气丸低剂量给药组(120mg/kg)、中剂量给药组(300mg/kg)和高剂量给药组(750mg/kg)，每组10只，连续灌胃给药30天，另设正常饲料不限饮食组为正常对照组。实验期间每隔3天称重1次，共30天，第31天眼球取血处死，再进行解剖取材。1.5bdi-gs评价脏器系数指标损益指数(bdi)＝受试物实验指标统计均值结果/空白对照对应指标均值结果，通过损益指数(benefit-damageindex,bdi)直观表示受试物对脏器组织的损益及程度。以bdi值为依据,通过累计积分(gsgeneralscore),作为整体综合效应的评价指标。累计gs值越大说明该受试物对机体的综合功效越高。1.6统计学方法采用graphpapprism7.0版本软件进行统计学分析，数据以均值表示，方差齐性检验，进行组别和体重或组别与各项生化指标的双因素分析，检测组间差异。p值<0.05为差异具有显著性。2.结果2.1小鼠体重变化趋势：对小鼠体重每隔3天称重1次并作图1与图2。图1为补中益气丸不同剂量低蛋白喂养雄性小鼠体重变化趋势图；图2为补中益气丸不同剂量低蛋白喂养雌性小鼠体重变化趋势图；从图1与图2体重变化趋势可见，与正常组比较，低蛋白低摄入量的空白对照小鼠体重生长呈现下降趋势，差异显著，但是给予低、中、高剂量的补中益气丸喂养后，小鼠体重比低蛋白低摄入量的空白对照组比较没有下降。说明在动物处于营养不良状态下或者脾虚情况下，连续灌胃补中益气丸没有影响到体重。2.2血液学指标的影响图3为补中益气丸对低蛋白喂养雄性小鼠血常规的影响；图4为补中益气丸对低蛋白喂养雌性小鼠血常规的影响；从图3与图4血常规来看，通过低蛋白低剂量的摄入，导致了模型对照鼠的血小板的增高，而灌服补中益气丸后，各给药组(高中低剂量)的血小板数量趋向恢复正常。2.3生化指标的影响2.3.1对肝功能图5为补中益气丸对低蛋白喂养雄性小鼠血液中肝功能的影响；图6为补中益气丸对低蛋白喂养雌性小鼠血液中肝功能的影响；从图5与图6可见，模型对照鼠alt、ast指标与正常组比较呈显著上升趋势，雄鼠用药后(高中低剂量)与模型对照鼠比较有所改善，而雌性鼠给药后(高中低剂量)与模型组比较均无显著差别，显示雄性小鼠用药后改善了肝损伤，但雌性对肝损伤无改善作用。2.3.2对肾功能图7为补中益气丸对低蛋白喂养雄性小鼠的肾功能影响；图8为补中益气丸对低蛋白喂养雌性小鼠的肾功能影响；从图7与图8可见，补中益气丸对低蛋白喂养的模型对照小鼠没有显著影响肾功能。2.4脏器系数的影响脏器重量指标及其bdi-gs的评价结果脏器重量bdi：代表受试物营养补益功效的评价指标。雌性大鼠的脏器系数bdi-gs的评价结果模型组低剂量组bdi中剂量组bdi高剂量组bdi心0.0050.0051.0000.0051.0000.0061.200肝0.0450.0440.9780.0380.8440.0491.089脾0.0020.0021.0000.0031.5000.0021.000肺0.0070.0071.0000.0071.0000.0081.143肾0.0100.0101.0000.0141.4000.0121.200胸腺0.0020.0031.5000.0021.0000.0021.000性腺0.0020.0021.0000.0021.0000.0021.000股骨头0.0060.0050.8330.0030.5000.0030.500大脑0.0140.0110.7860.0120.8570.0130.929胰腺0.0040.0020.5000.0051.2500.0051.250gs9.59710.35110.311雄性大鼠的脏器系数bdi-gs的评价结果图9为补中益气丸对低蛋白喂养雄性小鼠脏器的影响；图10为补中益气丸对低蛋白喂养雌性小鼠脏器的影响；从图9与图10可见，从各脏器重量指标及bdi可见补中益气丸没有对主要脏器产生不良影响。实施例3:江香薷的30天喂养毒性试验及评价1.实验材料与方法除受试药为江香薷外，其余与实施例2一致。江香薷的剂量和分组如下：江香薷低剂量为500mg/kg,中剂量为1000mg/kg，高剂量为2000mg/kg，其余设组与实施例2一样。2.结果2.1小鼠体重变化趋势图11为江香薷不同剂量低蛋白喂养雄性小鼠体重变化趋势图；图12为江香薷不同剂量低蛋白喂养雌性小鼠体重变化趋势图；从图11与图12体重变化趋势可见，与正常组比较，低蛋白低摄入量的模型小鼠体重生长呈现下降趋势，差异显著，但是用补中益气丸(高中低剂量)喂养后，小鼠体重比低蛋白低摄入量的模型组比较没有下降。2.2血液学指标的影响图13为江香薷对低蛋白喂养雄性小鼠血常规的影响；图14为江香薷对低蛋白喂养雌性小鼠血常规的影响；从图13与图14血常规看，通过低蛋白低剂量的摄入，导致了血小板的增高(模型对照组)，而灌服受试物后，各给药组(高中低剂量)的血小板数量趋向恢复正常。2.3生化指标的影响2.3.1对肝功能图15为江香薷对低蛋白喂养雄性小鼠血液中肝功能的影响；图16为江香薷对低蛋白喂养雌性小鼠血液中肝功能的影响；从图15与图16可见，模型对照鼠alt、ast指标与正常组比较呈显著上升趋势，雄鼠用药后(高中低剂量)与模型对照鼠比较有所改善，而雌性鼠给药后(高中低剂量)无显著差别。2.3.2对肾功能图17为江香薷对低蛋白喂养雄性小鼠的肾功能影响；图18为江香薷对低蛋白喂养雌性小鼠的肾功能影响；从图17与图18可见，江香薷没有对模型鼠的肾功能产生不良影响。2.4脏器重量指标及其bdi-gs的评价结果脏器重量bdi：代表受试物营养补益功效的评价指标。从各脏器重量指标及bdi可见：雌性大鼠的脏器系数bdi-gs的评价结果雄性大鼠的脏器系数bdi-gs的评价结果模型组低剂量组bdi中剂量组bdi高剂量组bdi心0.0060.0050.9300.0050.8640.0050.952肝0.0410.0400.9830.0431.0440.0400.976脾0.0040.0030.7420.0030.7990.0030.867肺0.0070.0060.9350.0070.9570.0070.992肾0.0110.0121.0860.0100.9040.0100.863胸腺0.0020.0031.1540.0020.8450.0020.989胰腺0.0060.0040.7770.0040.7210.0050.866性腺0.0110.0121.0440.0090.8240.0121.056大脑0.0120.0131.0780.0110.9220.0131.086股骨头0.0030.0031.0020.0031.0220.0020.835gs9.7318.9019.483图19为江香薷对低蛋白喂养雄性小鼠脏器的影响；图20为江香薷对低蛋白喂养雌性小鼠脏器的影响；从上表及从图19与图20可见，江香薷对模型鼠的脏器系数无不良影响。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。当前第1页1 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技术特征：1.一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法，其特征在于：使用断乳后一周的大鼠或小鼠，以低蛋白、低摄入量的饲喂投放方式进行喂养造模，同时给予连续三十天受试中药的饲喂。
2.根据权利要求1所述的一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法,其特征在于：所述的受试中药为补益类中药。
3.根据权利要求1所述的一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法,其特征在于：所述的低摄入量为动物正常喂养量的30-80％。
4.根据权利要求3所述的一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法,其特征在于：所述的低摄入量为动物正常喂养量的50％。
5.根据权利要求1所述的一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法,其特征在于：所述的低蛋白为低蛋白全价饲料；所述的低蛋白全价饲料为10％纯植物蛋白的饲料。
6.根据权利要求5所述的一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法,其特征在于：所述的10％纯植物蛋白的饲料，以质量百分比计，具体配方为：玉米50-60％、小麦30-40％、蜜糖酵母2-3％、磷酸氢钙1.5-2.5％、石粉0.8-1.2％、氯化胆碱0.15-0.25％、生长预粉料1％、食盐0.25-0.35％、油2-3％、豆粕0％、鱼粉0％、酪蛋白0％、控制粗蛋白含量为9-12％。
7.根据权利要求6所述的一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法,其特征在于：所述的10％纯植物蛋白的饲料，以质量百分比计，具体配方为：玉米55％、小麦35.5％、蜜糖酵母2.5％、磷酸氢钙2％、石粉1％、氯化胆碱0.2％、生长预粉料1％、食盐0.3％、油2.5％、豆粕0％、鱼粉0％、酪蛋白0％、控制粗蛋白含量为10-11％。
8.根据权利要求7所述的一种对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法,其特征在于：所述的生长预粉料为国家标准实验动物用的预粉料，内含物质元素以质量百分比计，包含有铜6％、铁6％、锰1.3％、锌4.2％、硒0.3％、镁1.5％、碘0.13％、钴0.02％、复合维生素0.4％。
9.根据权利要求1-8任一所述构建方法所获得的实验模型的应用，其特征在于：用于补益类中药进行安全评价。
10.根据权利要求9所述实验模型的应用，其特征在于，所述的安全评价具体为：通过对断乳后一周的大鼠或小鼠喂以低摄入量的低蛋白饲料的方式造成营养不良或脾虚的模型，同时连续三十天灌胃受试的补益类中药，三十天后采集动物的血液和组织，进行分析，并按bdi-gs的评价体系评价补益类中药对主要脏器的影响。
技术总结本发明涉及中药安全评价技术领域，具体公开了一种对补益类中药进行安全评价的实验模型构建方法。该构建方法使用断乳后一周的大鼠或小鼠，以低蛋白、低摄入量的饲喂投放方式进行喂养造模，同时给予连续三十天受试中药的饲喂。本发明通过对断乳后一周的大鼠或小鼠喂以低摄入量的低蛋白饲料的方式造成营养不良或脾虚的模型，同时连续三十天灌胃受试的补益类中药，三十天后采集动物的血液和组织，进行分析，并按BDI‑GS的评价体系评价补益类中药对主要脏器的影响。本发明所公开的对补益类中药进行安全评价实验模型的构建方法，填补了补益类中药的三十天安全评价实验模型的空白，也可用于补脾类中药的药效学研究,对于科学评价这类中药和复方具有重要意义。
技术研发人员：刘志勇;黄云;李龙雪;李守明;刘莉;雷丹;刘庆福;黄顺水;刘婷艳;梁芬;郑晓楠
受保护的技术使用者：江西中医药大学
技术研发日：2020.01.19
技术公布日：2020.06.09
