本发明涉及动物模型技术领域，具体地说，是关于一种肝硬化腹水动物模型及其构建方法。
背景技术：
目前肝硬化腹水动物模型的制备最常见的方法有四氯化碳(ccl4)造模法(含单用ccl4和联用苯巴比妥、乙醇、改良饮食等综合制备方法)，酒精性造模法、免疫造模法、胆总管结扎诱导法和化学致癌物诱导法(dmn造模法)。其中，ccl4造模法是最早、最经典的造模方法。本法的主要作用机制是是氧化应激反应，通过细胞色素p450将ccl4分解为三氯甲基和三氯甲基自由基，导致肝细胞脂质过氧化，引起细胞膜的变性损伤，变性坏死，因肝细胞本身具有修复功能，经过不断的损伤-修复-损伤的过程，最终发展为肝硬化。但本法造模周期长，死亡率高。酒精性造模法主要机制是，一方面酒精在肝内氧化代谢产生乙醛，直接具有肝细胞毒性，另一方面，酒精可激发体内免疫反应系统，诱发组织炎症反应，启动组织肝纤维程序。最终若不戒断酒精，则导致肝脏病变进一步加重。酒精性造模法，操作简单，费用低廉，可以辅助诸如四氯化碳法，减少造模周期，但是因动物拒绝饮用酒精，且酒精可致动物因缺水、电解质紊乱甚至脱水而死，故而存在缺陷。免疫造模法采用异体血清反复注射动物，产生机体变态反应，大量免疫复合物沉积，从而产生肝纤维化，其后继续随着病程发展肝硬化。但是本法造模时间长，死亡率高，且大鼠具有一定的自愈倾向。胆总管结扎法可以引起动物模型胆管扩张、肝内胆汁淤积，也可引发肝内胆小管扩张破裂，使肝细胞(hepaticcells)缺血坏死，慢慢进展为胆汁淤积型肝硬化。与人原发性胆汁性肝硬化发展有一定类似之处，但是手术操作难度大，对肝组织学影响较小，大鼠死亡率高，也有一定自愈倾向。化学致癌物诱导法中以dmn诱导最为常见，dmn具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性。dmn毒性发挥有赖于体内代谢的激活产生，经微粒体转化形成强烷化物可造成细胞内大分子损伤，诱发大鼠肝窦壁肝星状细胞(hsc)的活化，转化成肌层纤维细胞样细胞。hsc的激活一方面参与肝内结构的重建和肝纤维化的形成；另一方面使肝窦内压升高。故而，本法主要用于肝纤维化、肝硬化形成和门脉高压机制以及肝癌的研究。缺陷：因dmn试剂的剧毒性及剂量的难以把握而致的造模动物死亡率较高，因此剂量的把握尤为重要。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种肝硬化腹水动物模型。
本发明的第二个目的是，提供一种肝硬化腹水动物模型的构建方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种肝硬化腹水动物模型，所述的肝硬化腹水动物模型是通过以下方法制备得到：大鼠体重达到220g以后开始造模，用0.5％dmn溶液，按0.2ml/100g大鼠体重腹腔注射，每周周三、四、五各给药一次，其余周六、日、一、二均不予干预，共注射4周，前两周按原剂量注射，注射第三周开始根据大鼠体重调节给药量，调整幅度，根据以下方案：体重没有改变或减少小于10克，使用原剂量给药；体重减少10-30克使用75％的原剂量；体重减少31-50克使用50％的原剂量；体重下降超过50g时候，暂停注射一次，1周后剂量根据体重变化进行调整。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种肝硬化腹水动物模型的构建方法：所述的构建方法如下：大鼠体重达到220g以后开始造模，用0.5％dmn溶液，按0.2ml/100g大鼠体重腹腔注射，每周周三、四、五各给药一次，其余周六、日、一、二均不予干预，共注射4周，前两周按原剂量注射，注射第三周开始根据大鼠体重调节给药量，调整幅度，根据以下方案：体重没有改变或减少小于10克，使用原剂量给药；体重减少10-30克使用75％的原剂量；体重减少31-50克使用50％的原剂量；体重下降超过50g时候，暂停注射一次，1周后剂量根据体重变化进行调整。
本发明优点在于：本发明方法基于现有的alakokko造模法构建肝硬化腹水大鼠模型。本发明成功的通过方案的改良，成功的制备出稳定、可复制、操作性强的肝硬化腹水大鼠模型。为以后的肝硬化腹水动物实验打下基础。
附图说明
图1大鼠一般现象观察。a：模型组；b：正常组；c：打开腹腔可见淡黄澄清腹水。
图2肝脏形态学观察。c：正常组；d：模型组。
图3模型组腹腔可见无回声区。
图4大鼠肝脏he染色注：肝脏光学显微镜下10x：正常组l-1；对照组l-2；肝脏光学显微镜下20x：正常组m-1。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
一，实验材料、方法和结果。
实验材料：选择45只健康雄性清洁级wistar大鼠，6-8周龄，体重(200±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产合格证号：2015000557591。
实验方法：制备dmn诱导肝硬化腹水大鼠模型，45只雄性wistar大鼠，适应性喂养1周，待体重增加至240g左右开始造模，取5只大鼠作为正常组，其余大鼠参照alakokko造模法并改进，以0.5％dmn溶液，按0.2ml/100g大鼠体重腹腔注射，每周周三、四、五各给药一次，其余周六、日、一、二均不予干预，共注射4周，前两周按原剂量注射，注射第三周开始根据大鼠体重调节给药量，调整幅度，根据以下方案：体重没有改变或减少小于10克——原剂量给药；体重减少10-30克——75％的原剂量；体重减少31-50克——50％的原剂量；体重下降超过50g——暂停注射一次，1周后剂量根据体重变化进行调整。期间普通饮食，自由饮水。造模期间，密切关注大鼠体重、腹围，体重：每日测量并记录；腹围：前三周每周二、周五检测，后三周每日测量并记录。根据大鼠体重调节给药量，构建肝硬化腹水大鼠模型。
二，造模成功评判标准：
1.一般体征
大鼠精神倦怠，毛量稀疏、毛色泛黄，光泽度较差，腹部膨隆，腹水量较高时，可触及波动感。
2.腹腔穿刺
助手固定住大鼠的头部和四肢后，右侧卧位，充分暴露腹部，大鼠右下腹备皮约2cm×2cm，75％酒精局部消毒后，1ml注射器回抽，若抽出橙黄色液体，则造模成果。大鼠腹水量较大时诊断性穿刺可抽出腹水。
3.腹部b超
备皮：大鼠整个腹部(下至耻骨联合，上至剑突，左右分别旁开至双侧腋下，用动物剃毛器结合脱毛膏备皮)。麻醉：将含有异氟烷的湿棉球若干个放在大烧杯中，将大鼠放入，封口。大鼠先兴奋后抑制，自行倒下。当动物角膜反应迟钝，肌肉紧张度降低时，取出大鼠。若大鼠再次恢复肌肉紧张(挣扎)，可重复麻醉一次，待平静后即可开始实验。操作：助手固定大鼠头及四肢，充分暴露腹部，备皮处涂上耦合剂，用高频(7.5～10兆赫)探头探测大鼠腹部，并照相，声像图上显示为腹腔内有无回声暗区，即可诊断为腹水。
4.肝脏病理
(1)正常肝小叶破坏被假小叶取代；(2)假小叶：①所有假小叶周围都有纤维组织包绕；②肝细胞排列紊乱，有不同程度的变性、坏死、再生；(3)周围纤维结缔组织：有淋巴细胞的净润、小胆管的增生和假胆管的形成。
三，实验结果：
1.大鼠一般体征
与正常组相比，模型组大鼠可见精神疲软、毛色泛黄、光泽度差，腹部膨隆，对外界反应欠灵敏，饮食饮水减少，体重下降明显(见图1)。
2.肝脏形态学观察
肝脏表观上可见：(见图2)。
正常组：肝脏表面光滑，颜色鲜红。
模型组：肝脏体积缩小，颜色呈褐色或土黄色，边缘不圆润呈锯齿样，表面质地粗糙、凹凸不平，并可触及大小不等的类圆形结节，肝脏与网膜之间、不同肝叶之间存在粘连。
3.腹部b超：模型组腹腔可见无回声区(见图3)。
4.肝脏he染色(见图4)。
镜下可见：
正常组：肝细胞大小一致，形态正常，细胞呈条索状排列，肝小叶结构完整，汇管区未见异常。
模型组：肝细胞排列紊乱，肝细胞肿胀，有不同程度的变性、坏死、再生，正常肝小叶破坏被假小叶取代，假小叶周围有纤维组织包绕，大量炎性细胞浸润见于汇管区。
5.大鼠成模率
实验五周后大鼠成模率：90％(40只大鼠，成模36只)，存活率：97.5％，死亡率：2.5％(1只大鼠因麻醉过量死亡)。(见表1)。
表1大鼠成模率
*对照组1例因麻醉过量死亡
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
1.一种肝硬化腹水动物模型，其特征在于，所述的肝硬化腹水动物模型是通过以下方法制备得到：大鼠体重达到220g以后开始造模，用0.5％dmn溶液，按0.2ml/100g大鼠体重腹腔注射，每周周三、四、五各给药一次，其余周六、日、一、二均不予干预，共注射4周，前两周按原剂量注射，注射第三周开始根据大鼠体重调节给药量，调整幅度，根据以下方案：体重没有改变或减少小于10克，使用原剂量给药；体重减少10-30克使用75％的原剂量；体重减少31-50克使用50％的原剂量；体重下降超过50g时候，暂停注射一次，1周后剂量根据体重变化进行调整。
2.一种肝硬化腹水动物模型的构建方法：其特征在于，所述的构建方法如下：大鼠体重达到220g以后开始造模，用0.5％dmn溶液，按0.2ml/100g大鼠体重腹腔注射，每周周三、四、五各给药一次，其余周六、日、一、二均不予干预，共注射4周，前两周按原剂量注射，注射第三周开始根据大鼠体重调节给药量，调整幅度，根据以下方案：体重没有改变或减少小于10克，使用原剂量给药；体重减少10-30克使用75％的原剂量；体重减少31-50克使用50％的原剂量；体重下降超过50g时候，暂停注射一次，1周后剂量根据体重变化进行调整。
技术总结