本发明属于体内试验用的配制品技术领域，尤其涉及一种大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型及其构建方法。
背景技术：
目前，业内常用的现有技术是这样的：铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa，p.a)是常见的难治性院内感染致病菌，所致的多种感染和其形成生物膜(biofim，bf)有关，相关基因都受到群体感应系统(quorumsensing,qs)的调控。临床上一些慢性和难治性感染，如慢性呼吸道感染、慢性泌尿生殖系统感染、骨髓炎、心内膜炎、中耳炎、前列腺炎、牙周炎以及体内留置导管等的感染等很多学科的疾病大都与此有密切关系，现在铜绿假单胞菌感染是各种医院内感染中最广泛、最严重的问题之一，由它引起的院内感染高达30％以上，其中以呼吸道感染居首。因此，关于铜绿假单胞菌生物膜肺炎的研究对临床这类疾病的防治有重要意义。现有铜绿假单胞菌生物膜体外的模型制备技术已经基本成熟，相关抗生素、中药等的敏感性检测研究较多，但是体内模型的制备一直不理想。浮游菌的肺部感染模型发现不同途径致大鼠肺炎模型的制备，滴鼻途径感染造模方式相对手术植入细菌操作简单，创伤小，动物死亡率明显下降，而感染结果差异不大。临床上，铜绿假单胞菌生物膜感染非常常见，治疗效果差，疗程长，经济负担重，最常见难治的就是肺内的感染，影响病人的呼吸功能，生活质量明显下降。一直以来，肺内无法植入载体，气管切开手术创伤大，动物死亡率非常高，限制了这方面的研究。现在铜绿假单胞菌生物膜感染的动物模型大多采取两种方法，(1)体外制备的带有铜绿假单胞菌生物膜的载体移植体内模拟这种感染，造模方法动物死亡率极高，载体只能放在腹腔，气管等处，无法模拟没有异物的细菌生物膜感染；(2)藻酸盐等模拟生物膜包裹细菌打入体内，细菌不是真正的生物膜包裹的结构，致病性差异较大。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)体外制备的带有铜绿假单胞菌生物膜的载体移植体内模拟感染，造模方法动物死亡率极高，载体只能放在腹腔，气管等处，无法模拟没有异物的细菌生物膜感染。
(2)藻酸盐等模拟生物膜包裹细菌打入体内，细菌不是真正的生物膜包裹的结构，致病性差异较大，不能真正说明临床这种疾病的致病性。
解决上述技术问题的难度和意义：目前还没有这类临床发生越来越广泛却难治性呼吸系统感染的良好动物模型，加快这类疾病机制的基础研究，以解决临床这个重大的慢性难治性感染的问题，本发明的方法解决了这个问题的基本前提，有了很好的动物模型，就能够更加深入研究这类疾病，找到解决方法。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型及其构建方法。
本发明是这样实现的，一种大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型，所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型为大鼠常规麻醉后，大鼠鼻孔处于45度向上倾斜，将0.6ml菌液以微量加样器滴入鼻腔深处，大鼠体位保持直立位1min，菌液进入气管支气管。
本发明的另一目的在于提供一种所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型的构建方法，所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型的构建方法包括以下步骤：
步骤一，细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种5mllb培养液中37℃，振摇后将菌液离心，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，将细菌悬浮液用生理盐水调整od600＝0.05菌液备用，获得p.aeruginosa的浮游菌；
步骤二，采用6孔板法构建bf，加入6孔板每孔加入0.1ml菌液 2mllb肉汤培养基，放入37℃孵箱静置培养3d，第2天换液，培养3d后6孔板底部形成明显的膜状物，弃掉上清，用生理盐水洗涤2次以除去浮游菌，用细胞刮将在孔底部形成的bf刮下，转移到无菌离心管中在振荡器上充分震荡使bf分散开来，离心去上清用无菌生理盐水重悬稀释，获得细菌p.aeruginosa的被膜菌；
步骤三，涂片，染色观察铜绿假单胞菌生物膜；
步骤四，滴鼻感染，大鼠常规麻醉后，使大鼠鼻孔处于45度向上倾斜状态，将0.6ml菌液以微量加样器滴入鼻腔深处，改变大鼠体位，保持直立位1min，确保菌液进入气管支气管；感染1d，3d，7d，14d后检测大鼠肺部感染情况，病理变化。
进一步，所述步骤一中200rmin-1振摇20h后将菌液3000rmin-1离心10min。
进一步，所述步骤二中离心去上清用无菌生理盐水重悬稀释为od600＝0.05的菌液。
本发明的另一目的在于提供一种由所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗慢性呼吸道感染的药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗慢性泌尿生殖系统感染的药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗骨髓炎的药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗牙周炎的药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗中耳炎的药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗留置导管感染的药物。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：体外培养的铜绿假单胞菌生物膜结构，用调好浓度的细菌悬液放入六孔板内培养出生物膜结构；用细胞刮刮下来，震荡后变成小片的生物膜结构，检测调整细菌浓度。本发明提供的细菌生物膜结构真实稳定，重复性好，准备好的铜绿假单胞菌生物膜悬液采用滴鼻法造成大鼠的肺部感染，然后确定致病机制和干预治疗效果；动物模型更接近人体细菌生物膜肺部感染病理变化。
附图说明
图1是本发明实施例提供的大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型的构建方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明动物模型的成功构建，为疾病病理过程，干预治疗效果的观察提供了很好的条件。
本发明实施例提供的大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型为大鼠常规麻醉后，使大鼠鼻孔处于45度向上倾斜状态，将0.6ml菌液以微量加样器滴入鼻腔深处，再改变大鼠体位，使其保持直立位约1min，确保菌液进入气管支气管。
如图1所示，本发明实施例提供的大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型的构建方法包括以下步骤：
s101：将细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种5mllb培养液中37℃，200rmin-1振摇20h后将菌液3000rmin-1离心10min，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，将细菌悬浮液用生理盐水调整od600＝0.05菌液备用，此法所获得的细菌即为p.aeruginosa的浮游菌；
s102：获得p.aeruginosa-bf的构建及bf菌悬液，采用6孔板法构建bf，加入6孔板每孔加入0.1ml菌液 2mllb肉汤培养基，放入37℃孵箱静置培养3d，第2天小心换液，培养3d后6孔板底部形成明显的膜状物，弃掉上清，用生理盐水洗涤2次以除去浮游菌，然后用细胞刮将在孔底部形成的bf刮下来，转移到无菌离心管中在振荡器上充分震荡使bf分散开来，离心去上清用无菌生理盐水重悬稀释为od630＝0.06的菌液，此法所获得的细菌即为p.aeruginosa的被膜菌；
s103：可涂片，染色观察铜绿假单胞菌生物膜情况；
s104：滴鼻感染，大鼠常规麻醉后，使大鼠鼻孔处于45度向上倾斜状态，将0.6ml菌液以微量加样器滴入鼻腔深处，再改变大鼠体位，使其保持直立位约1min，确保菌液进入气管支气管。感染1d，3d，7d，14d后可检测大鼠肺部感染情况，病理变化，及干预治疗观察效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型，其特征在于，所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型为大鼠常规麻醉后，大鼠鼻孔处于45度向上倾斜，将0.6ml菌液以微量加样器滴入鼻腔，大鼠体位保持直立位1min，菌液进入气管支气管。
2.一种如权利要求1所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型的构建方法，其特征在于，所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型的构建方法包括以下步骤：
步骤一，细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种5mllb培养液中37℃，振摇后将菌液离心，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，将细菌悬浮液用生理盐水调整od600＝0.05菌液备用，获得p.aeruginosa的浮游菌；
步骤二，采用6孔板法构建bf，加入6孔板每孔加入0.1ml菌液 2mllb肉汤培养基，放入37℃孵箱静置培养3d，第2天换液，培养3d后6孔板底部形成明显的膜状物，弃掉上清，用生理盐水洗涤2次以除去浮游菌，用细胞刮将在孔底部形成的bf刮下，转移到无菌离心管中在振荡器上充分震荡使bf分散开来，离心去上清用无菌生理盐水重悬稀释，获得细菌p.aeruginosa的被膜菌；
步骤三，涂片，染色观察铜绿假单胞菌生物膜；
步骤四，滴鼻感染，大鼠常规麻醉后，使大鼠鼻孔处于45度向上倾斜状态，将0.6ml菌液以微量加样器滴入鼻腔，改变大鼠体位，保持直立位1min，确保菌液进入气管支气管；感染1d，3d，7d，14d后检测大鼠肺部感染情况，病理变化。
3.如权利要求2所述的大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型的构建方法，其特征在于，所述步骤一中200rmin-1振摇20h后将菌液3000rmin-1离心10min。
4.如权利要求2所述的大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中离心去上清用无菌生理盐水重悬稀释为od600＝0.05的菌液。
5.一种由权利要求1所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗慢性呼吸道感染的药物。
6.一种由权利要求1所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗慢性泌尿生殖系统感染的药物。
7.一种由权利要求1所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗骨髓炎的药物。
8.一种由权利要求1所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗牙周炎的药物。
9.一种由权利要求1所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗中耳炎的药物。
10.一种由权利要求1所述大鼠肺部铜绿假单胞菌生物膜感染模型得到的治疗留置导管感染的药物。
技术总结