本发明涉及一种利用组培技术制备肠道无菌昆虫幼虫模型的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
昆虫的种类丰富多样，其体内栖息着大量的微生物。这些微生物与宿主昆虫在长期协同进化过程中形成了相互依存的共生关系。共生菌在昆虫的营养、代谢、免疫和生殖等诸多生理功能上发挥着重要作用。
为研究探索昆虫与其肠道菌群协同互作的分子生理学机制，建立一种肠道内无菌的昆虫幼虫动物模型有助于研究肠道菌群在昆虫发育、代谢、免疫等诸多生理功能的作用，以及肠道微生物-昆虫-植物三者之间的协同进化关系。
目前获得肠道内无菌的昆虫幼虫的方法包括：抗生素处理、无菌人工饲料等。然而通过饲喂抗生素清除昆虫肠道菌群，由于受抗生素自身的作用功效局限和昆虫肠道环境因子的影响，抗生素饲喂的方法并不能完全清除昆虫肠道菌群；而利用无菌人工饲料饲养昆虫，由于改变了昆虫自然食物及寄主植物提供给昆虫的生活栖境，从而会影响无菌昆虫模型的建立，而且一种人工饲料并不适合所有昆虫，人工饲料的研制费时费力。上述因素制约了无菌昆虫幼虫的模型建立，也限制了昆虫肠道微生物的研究。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种肠道无菌的昆虫幼虫动物模型的创建方法，利用组织培养技术得到的无菌植株饲喂植食性昆虫幼虫，进而获得相应的肠道内完全无菌的昆虫幼虫。组织培养技术得到的无菌植株优势在于可以人工获得大量的无菌寄主植物，昆虫取食原寄主植物不存在改变食物而引起不适应的症状；保证了无菌昆虫的正常发育。而且肠道内的微生物也能通过该方法完全清除。
本发明的第一个目的是提供一种肠道无菌昆虫幼虫的制备方法，所述方法是利用组织培养技术得到的无菌植株饲喂昆虫幼虫，进而获得相应的肠道内完全无菌的昆虫幼虫；所述昆虫幼虫是由经消毒处理后的受精卵孵化而成。
在本发明的一种实施方式中，所述昆虫为植食性昆虫，包括茶尺蠖、柳蓝叶甲。
在本发明的一种实施方式中，所述消毒处理是将受精卵粒浸泡在消毒液中。
在本发明的一种实施方式中，所述消毒液为次氯酸钠或乙醇。
在本发明的一种实施方式中，所述次氯酸钠浓度为1-5％(v/v)，浸泡时间为0.5-5min。
在本发明的一种实施方式中，所述乙醇浓度为50-90％(v/v)，浸泡时间为1-10min。
在本发明的一种实施方式中，优选地，乙醇浓度为浸泡在浓度为75％乙醇溶液中5min。
在本发明的一种实施方式中，无菌植株为无菌组培苗。
在本发明的一种实施方式中，所述孵化条件为：温度为22-26℃；湿度为60-85％；光照时间/黑暗时间＝(14-18)h/(6-10)h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)收集昆虫的受精卵，选取生长状况良好的雌雄成虫配对，交配产卵后收集受精卵粒；
(2)将收集的卵粒浸泡在消毒液中进行杀菌消毒，以充分清除卵粒表面的微生物；
(3)用无菌纯水淋洗经消毒液浸泡后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的消毒液，然后将淋洗后的卵粒用无菌滤纸吸干水分、晾干；
(4)将晾干的卵粒移入到具有无菌组培苗或组培叶片的容器中，用无菌透气封口膜封口，上述操作均在无菌环境中进行；
(5)将步骤(4)的容器放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度为22-26℃；湿度为60-85％；光照时间/黑暗时间＝(14-18)h/(6-10)h，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长，从而获得肠道无菌的昆虫幼虫。
本发明的第二个目的是提供一种应用上述方法制备得到的肠道无菌昆虫幼虫。
本发明的第三个目的是提供一种上述肠道无菌昆虫幼虫在作为昆虫动物模型方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明使用乙醇浸泡昆虫卵粒5分钟，即可达到表面充分消毒且孵化率高的效果，孵化率高达75.8％；次氯酸钠处理反而容易将卵粒过度氧化，死亡率高；
(2)本发明以无菌的组培苗喂食孵化出的幼虫，可避免外源微生物进入昆虫肠道，与抗生素相比，能够完全地去除茶尺蠖肠道内细菌，从而获得肠道无菌的昆虫动物模型；实验中所用的无菌组培苗培养温度在25±2℃下，可适当延长光照周期，从而达到快速繁殖的目的，以供昆虫幼虫取食所需。因此，本肠道无菌的昆虫动物模型的建立将极大地促进昆虫与其肠道菌群协同互作的相关机制研究。
(3)本发明采用组培苗和卵粒杀菌联合处理能100％清除茶尺蠖肠道内细菌，较组培苗和卵粒杀菌单独处理之和更优越，具有协同作用。
附图说明
图1为茶尺蠖卵粒乙醇处理，次氯酸钠处理以及不处理在lb培养基上的菌落情况；(a)茶尺蠖卵粒经乙醇浸泡，漂洗后在lb培养基上培养；(b)茶尺蠖卵粒经次氯酸钠浸泡，漂洗后在lb培养基上培养；(c)茶尺蠖卵粒不经过处理在lb培养基上培养。
图2为(a)茶尺蠖卵粒经75％乙醇浸泡5分钟，用无菌水漂洗两次，滤纸吸干水分后晾干，取20粒卵充分研磨后在lb培养基上涂布划线；(b)茶尺蠖卵粒不经过处理，取20粒卵充分研磨后在lb培养基上涂布划线。
图3为茶尺蠖饲养方式；(a)茶尺蠖卵粒浸泡在浓度为75％的乙醇溶液中5分钟，无菌水漂洗两次，用滤纸吸干水分，晾干后接到无菌的组培茶苗中；(b)茶尺蠖卵粒浸泡在浓度为75％的乙醇溶液中5分钟，无菌水漂洗两次，用滤纸吸干水分，晾干后接到野外茶树叶片中；(c)茶尺蠖卵不做处理饲喂野外茶树叶片。
图4为茶尺蠖幼虫肠道内细菌菌落在lb培养基上的生长情况；(a)茶尺蠖卵粒浸泡在浓度为75％的乙醇溶液中5分钟，无菌水漂洗两次，用滤纸吸干水分，晾干后接到无菌的组培茶苗中生长发育；(b)茶尺蠖卵粒浸泡在浓度为75％的乙醇溶液中5分钟，无菌水漂洗两次，用滤纸吸干水分，晾干后接到野外茶树叶片中生长发育；(c)茶尺蠖卵不做处理在野外茶树叶片上生长发育；(d)茶尺蠖卵不做处理在无菌的组培茶苗中生长发育。
图5为利用pcr技术检测茶尺蠖幼虫的肠道内是否存在细菌的实验结果；(a)茶尺蠖卵粒浸泡在浓度为75％的乙醇溶液中5分钟，无菌水漂洗两次，用滤纸吸干水分，晾干后接到无菌的组培茶苗中生长发育；(b)茶尺蠖卵粒浸泡在浓度为75％的乙醇溶液中5分钟，无菌水漂洗两次，用滤纸吸干水分，晾干后接到野外茶树叶片中生长发育；(c)茶尺蠖卵不做处理在野外茶树叶片上生长发育；ck:空白对照；m为marker。
图6为柳蓝叶甲卵粒乙醇处理和不处理的对照在lb培养基上的菌落情况。
图7为乙醇溶液浸泡处理和不做处理的对照的幼虫存活率。
图8为利用pcr技术检测柳蓝叶甲幼虫的肠道内是否存在细菌的实验结果。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1：
一种肠道无菌的茶尺蠖幼虫动物模型的创建方法，包括以下步骤：
1)选取生长状况良好的茶尺蠖雌雄成虫，交配产卵后收集1-2日龄、3-4日龄、5-6日龄不同卵期的新鲜卵粒；
2)将收集不同卵期的卵粒浸泡在浓度为1％、3％、5％的次氯酸钠溶液中0.5min、1.5min、5min，利用spss设计三因素三水平的正交实验(如表1)，以清除卵粒表面的细菌；
3)用无菌纯水淋洗经次氯酸钠漂洗后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的次氯酸钠溶液，然后将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分，晾干后转移至lb培养基上；
4)将lb培养基放置在人工气候室中，人工气候的条件为：温度(26-22)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h-14h/10h，保持气候室内空气洁净，连续观察10天卵粒死亡及染菌情况；实验结果见表2。
表1次氯酸钠处理的因素和水平
表2正交结果(次氯酸钠为消毒液)
统计结果表明卵粒未感染死亡率为46％，如图1b所示，卵粒经次氯酸钠处理后卵壳容易氧化，死亡率高。
实施例2：
一种肠道无菌的茶尺蠖幼虫动物模型的创建方法，包括以下步骤：
1)选取生长状况良好的茶尺蠖雌雄成虫，交配产卵后收集1-2日龄、3-4日龄、5-6日龄不同卵期的新鲜卵粒；
2)将收集不同卵期的卵粒浸泡在浓度为50％、75％、90％的乙醇溶液中1min、5min、10min，以清除卵粒表面的细菌，利用spss设计三因素三水平的正交实验(如表3)；
3)用无菌纯水淋洗经乙醇漂洗后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的乙醇溶液，然后将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分，晾干后转移至lb培养基上；
4)将lb培养基放置在人工气候室中，人工气候的条件为：温度(26-22)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h-14h/10h，保持气候室内空气洁净，连续观察10天卵粒死亡及染菌情况；实验统计结果见表4；经spss(v23.0)统计软件分析结果见表5、6。
表3乙醇处理的因素和水平
表4正交实验结果(乙醇为消毒液)
表5主体间效应检验
因变量:未感染死亡率；a.r方＝.490(调整后r方＝-1.042)
表6估算边际平均值
因变量：未感染死亡率
从表4可以看出乙醇处理组的茶尺蠖卵的未感染死亡率均在90％以上，如图1a所示；从表5可以看出iii类平方和值由大到小是b>a＝c，a、b、c的p值均大于0.05；从表6可以看出胚胎期1～2d的平均值低于3～4d和5～6d，75％乙醇平均值高于50％乙醇和95％乙醇，时间1min的平均值低于5min和10min。所以选择雌虫产卵3-4天的卵粒，浸泡在75％的乙醇中，以充分消除卵粒表面的细菌。
实施例3：
为了进一步验证实施例2中选择的方法是否达到表面消毒的效果，做了实施例3验证，包括以下步骤：
1)选取生长状况良好的茶尺蠖雌雄成虫，交配产卵后收集3-4日龄的新鲜卵粒；
2)将收集的卵粒浸泡在浓度为75％乙醇溶液中5min、以充分清除卵粒表面的细菌；
3)用无菌纯水淋洗经乙醇漂洗后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的乙醇溶液，然后将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分，晾干后，取20个茶尺蠖卵粒研磨充分，研磨液在lb培养基上涂布划线；
4)将lb培养基放置在37°培养箱中培养，观察平板上菌落情况(如图2所示)。
实施例4：
1)选取生长状况良好的茶尺蠖雌雄成虫，交配产卵后收集3-4日龄的新鲜卵粒；
2)将收集的卵粒浸泡在浓度为75％乙醇溶液中5min、以充分清除卵粒表面的细菌；
3)用无菌纯水淋洗经乙醇漂洗后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的乙醇溶液，然后将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分、晾干；
4)在茶树组培苗茎段及愈伤组织培养，快繁，生根过程中，组培室光照周期从12h光照/12h黑暗延长16h光照/8h黑暗，能够明显促进茶苗的光合及生长，提供茶尺蠖幼虫取食。
5)用接种环将晾干的卵粒接到无菌的组培苗瓶中，每个瓶中接10-15个卵粒，以保证瓶中的组培苗足够幼虫生长发育，用无菌透气封口膜封上瓶口，编号为a；
6)将瓶放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度(26-22)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h-14h/10h，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长，监测幼虫饲养过程的生理指标；监测结果如表7。
统计结果显示，幼虫成活率为75.8％，卵期7±1d，幼虫期为13-17d，雌虫蛹重：101.3±17.2mg，雄虫蛹重：55.5±10.6mg。
对比例1：单独受精卵杀菌
1)选取生长状况良好的茶尺蠖雌雄成虫，交配产卵后收集3-4日龄的新鲜卵粒；
2)将收集的卵粒浸泡在浓度为75％乙醇溶液中5min、以充分清除卵粒表面的细菌；
3)用无菌纯水淋洗经乙醇漂洗后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的乙醇溶液，然后将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分、晾干；
4)用接种环将晾干的卵粒接到含有野外茶树叶片的瓶中，每个瓶中接10-15个卵粒，以保证瓶中的茶树叶片足够幼虫生长发育，用无菌透气封口膜封上瓶口，编号为b；
5)将瓶放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度(26-22)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h-14h/10h，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长，监测幼虫饲养过程的生理指标；监测结果如表7。
统计结果显示，幼虫成活率为71.0％，卵期7±1d，幼虫期为16-19d，雌虫蛹重：112.3±21.1mg，雄虫蛹重：62.0±8.5mg。
对比例2：空白组
1)选取生长状况良好的茶尺蠖雌雄成虫，交配产卵后收集3-4日龄的新鲜卵粒；
2)在超净工作台中，将野外茶树叶片放在瓶中，收集的卵粒直接放到瓶中，每个瓶子里放10-15个卵，以保证瓶中的茶树叶片足够幼虫生长发育，用无菌透气封口膜封上瓶口，编号为c；
3)将瓶放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度(26-22)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h-14h/10h，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长，监测幼虫饲养过程的生理指标；监测结果如表7。
统计结果显示，幼虫成活率为96.2％，卵期7±1d，幼虫期为16-19d，雌虫蛹重：110.8±16.9mg，雄虫蛹重：62.9±7.7mg。
表7幼虫饲养生理指标监测结果
注：表中数字为m±sd，*表明p<0.05:有显著性差异。
从实施例4、5、6统计结果来看，a、b、c三组在饲养过程中，幼虫历期上基本一致，能够正常生长，但是在雌雄蛹重上有显著差异。为检测肠道内是否有细菌存在，待幼虫发育至3、4龄时，解剖提取肠道用于制备肠道研磨液和提取肠道细菌总dna，分别采用涂平板的方法(实验结果见图4)和利用细菌通用引物27f,1492r进行pcr扩增(实验结果见图5)来确定肠道内是否存在细菌。
对比例3：单独组培苗饲喂
1)选取生长状况良好的茶尺蠖雌雄成虫，交配产卵后收集3-4日龄的新鲜卵粒；
2)在茶树组培苗茎段及愈伤组织培养，快繁，生根过程中，组培室光照周期从12h光照/12h黑暗延长16h光照/8h黑暗，能够明显促进茶苗的光合及生长，提供茶尺蠖幼虫取食。
3)用新鲜卵粒接到无菌的组培苗瓶中，每个瓶中接10-15个卵粒，以保证瓶中的组培苗足够幼虫生长发育，用无菌透气封口膜封上瓶口，编号为d；
6)将瓶放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度(26-22)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h-14h/10h，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长。
对比例4：
1)选取生长状况良好的茶尺蠖雌雄成虫，交配产卵后收集3-4日龄的新鲜卵粒；
2)将收集的卵粒浸泡在浓度为75％乙醇溶液中5min、以充分清除卵粒表面的细菌；
3)用无菌纯水淋洗经乙醇漂洗后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的乙醇溶液，然后将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分、晾干；
4)对野外茶树叶片进行无菌处理：将新鲜茶树叶片放于自来水下冲洗1小时，后在75％乙醇溶液中浸泡5分钟，无菌水冲洗两次，再用1％次氯酸钠溶液浸泡5分钟，无菌水漂洗两次，滤纸沥干水分；
5)用接种环将晾干的卵粒接到含有表面消毒后的野外茶树叶片的瓶中，每个瓶中接10-15个卵粒，以保证瓶中的茶树叶片足够幼虫生长发育，用无菌透气封口膜封上瓶口；
6)将瓶放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度(26-22)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h-14h/10h，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长，得到的昆虫幼虫，待幼虫到3、4龄时取其肠道，提取肠道dna，经pcr扩增16srdna后，琼脂糖凝胶电泳发现有亮条带出现，说明野外茶树叶片表面消毒处理饲喂茶尺蠖，不能获得肠道无菌的幼虫模型。
图1结果显示，茶尺蠖卵粒经乙醇浸泡能够达到表面消毒的效果，且感染率和死亡率低，而次氯酸钠处理则死亡率高。不做处理的对照组则长满菌落。
图2结果显示与不做处理的卵粒做对照，进一步证实经过乙醇表面消毒后茶尺蠖卵粒不携带细菌。
图3结果显示abc三组处理的茶尺蠖卵均可以正常孵化成幼虫，且a组茶尺蠖排出的粪便未看到微生物菌落，而b和c组粪便上附着菌落。
图4结果显示，a组茶尺蠖卵粒经过表面消毒后饲喂在无菌组培苗中，培养基上无菌落，说明幼虫肠道内无可培养细菌；b组茶尺蠖卵粒经过乙醇表面消毒后饲喂野外茶树叶片，培养基上有菌落；c组茶尺蠖卵粒不经过处理饲喂野外茶树叶片培养基上长满菌落；d组为茶尺蠖卵粒不经过处理饲喂在无菌组培苗中，培养基长满菌落；观察菌落情况可知，相对于c组，a组菌落100％清除；b组清除了75％，d组清除了20％，可见，组培苗和卵粒杀菌联合处理较两者单独处理之和更优越。
图5经过乙醇溶液浸洗且饲养在无菌组培茶苗里的幼虫肠道中没有扩增出细菌的16srdna片段，其它实验组均有扩增出靶片段，这说明只有这组条件饲养下的幼虫肠道内无细菌存在。因此，图4和图5中的试验结果证明，乙醇溶液浸泡处理后的卵饲养在无菌组培茶苗中放置于人工气候室内饲养获得的幼虫肠道内无细菌存在，这说明采用本发明方法能够成功获得肠道无菌的茶尺蠖幼虫模型。
实施例5：
一种肠道无菌的柳蓝叶甲幼虫动物模型的创建方法，包括以下步骤：
1)选取生长状况良好的柳蓝叶甲雌雄成虫，交配产卵后收集2日龄卵期的新鲜卵粒；
2)将收集的卵粒浸泡在75％的乙醇溶液中5min，以清除卵粒表面的细菌。
3)用无菌水淋洗经乙醇溶液漂洗后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的乙醇溶液，将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分，晾干后用无菌的毛笔刷轻轻转移至lb固体培养基上；
4)将lb固体培养基放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度(28-26)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝16h/8h，保持气候室内空气洁净，连续观察2天卵粒死亡及染菌情况；实验统计结果见表8。
表8乙醇处理卵后消毒效果检测
从表8可以看出乙醇处理组的柳蓝叶甲卵的未感染死亡率均在90％以上，说明在75％的乙醇溶液中浸泡5min，能够充分消除卵粒表面的细菌。
实施例6：
为了进一步验证实施例5中选择的方法是否达到表面消毒的效果，做了实施例8验证，包括以下步骤：
选取生长状况良好的柳蓝叶甲雌雄成虫，交配产卵后收集2日龄的新鲜卵粒；
将收集的卵粒浸泡在浓度为75％乙醇溶液中5min，以充分清除卵粒表面的细菌；
用无菌水淋洗经乙醇溶液漂洗后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的乙醇溶液，然后将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分，晾干后取20个柳蓝叶甲卵粒研磨充分，研磨液在lb固体培养基上涂布；
作为对照，取20粒无菌水冲洗的柳蓝叶甲卵粒，充分研磨后，将研磨液涂布在lb固体培养基上。
将lb固体培养基放置于37℃培养箱中培养24h，观察平板上菌落情况(如图6所示)。
实施例7：
1)选取生长状况良好的柳蓝叶甲雌雄成虫，交配产卵后收集2日龄的新鲜卵粒；
2)在超净工作台中，将收集的卵粒用无菌水冲洗后直接放在含有无菌的杨树组培苗的培养皿中，每个叶片上放10-15个卵，每天更换新鲜叶片，以保证皿中的杨树叶片足够幼虫生长发育，用无菌透气封口膜封上皿口，编号为a，作为对照；
3)将皿放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度(28-26)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长，监测幼虫饲养过程的生理指标；监测结果如表9。统计结果显示，卵孵化率为95.9％，卵期3d，幼虫期为7±1d，化蛹率96.0％。
实施例8：
1)选取生长状况良好的柳蓝叶甲雌雄成虫，交配产卵后收集2日龄的新鲜卵粒；
2)将收集的卵粒浸泡在浓度为75％乙醇溶液中5min，以充分清除卵粒表面的细菌；
3)用无菌水漂洗经乙醇溶液浸泡后的卵粒，洗净卵粒表面可能残留的乙醇溶液，然后将淋洗后的卵粒用滤纸吸干水分、晾干；
5)用无菌毛笔刷将晾干的卵粒放置于含有无菌的杨树组培苗的培养皿中，每个叶片上接10-15粒卵，每天更换新鲜的无菌杨树叶片，以保证皿中的无菌叶片足够幼虫生长发育，用无菌透气封口膜封上瓶口，编号为b；
6)将培养皿放置于人工气候室中，人工气候的条件为：温度(28-26)℃；湿度(85-60)％；光照时间/黑暗时间＝18h/6h，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长，监测幼虫饲养过程的生理指标；监测结果如表9。统计结果显示，卵孵化率为95.3％，卵期3d，幼虫期为7±1d，化蛹率95.3％。
表9幼虫饲养生理指标监测结果
从实施例9、10统计结果来看，a、b组在饲养过程中，幼虫历期上基本一致，能够正常生长。同时每天记录幼虫的存活个数(实验结果见图7)，来确定乙醇处理是否影响幼虫的存活率。为检测肠道内是否有细菌存在，待幼虫发育至3、4龄时，解剖分离肠道用于肠道细菌总dna提取，利用细菌通用引物8f/1492r进行pcr扩增(实验结果见图8)来确定肠道内是否存在细菌。
图6结果显示，柳蓝叶甲卵粒经乙醇溶液浸泡后，培养基上未生长菌落，而不做处理的对照则长满菌落，表明乙醇溶液浸泡能够达到表面消毒的效果。
图7结果显示，乙醇溶液浸泡处理后幼虫存活率与不做处理的对照没有显著性差异，且存活率均在90％以上，说明乙醇溶液浸泡消毒不影响幼虫的存活率。
图8结果显示，经过乙醇溶液浸泡且饲养在无菌组培杨树苗上的幼虫肠道中没有扩增出细菌的16srdna片段，而不做处理的对照组能够扩增出靶片段，说明这种饲养下的幼虫肠道内无细菌存在。
因此，75％乙醇溶液浸泡处理后的卵饲养在无菌的组培杨树苗上，并放置于人工气候室内饲养获得的幼虫，肠道内无细菌存在。这说明采用本发明方法能够成功获得肠道无菌的柳蓝叶甲幼虫模型。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
1.一种肠道无菌昆虫幼虫的制备方法，其特征在于，所述方法是利用组织培养技术得到的无菌植株饲喂昆虫幼虫，进而获得相应的肠道内完全无菌的昆虫幼虫；所述昆虫幼虫是由经消毒处理后的受精卵孵化而成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒处理是将受精卵粒浸泡在消毒液中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒液为次氯酸钠或乙醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述次氯酸钠浓度为1-5％，浸泡时间为0.5-5min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乙醇浓度为50-90％，浸泡时间为1-10min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无菌植株为无菌组培苗。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵化条件为：温度为22-26℃；湿度为60-85％；光照时间/黑暗时间＝(14-18)h/(6-10)h。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)收集昆虫的受精卵，选取生长状况良好的雌雄成虫配对，交配产卵后收集受精卵粒；
(2)将收集的卵粒浸泡在乙醇溶液中进行杀菌消毒；
(3)用无菌纯水淋洗经乙醇浸泡后的卵粒，然后将淋洗后的卵粒用无菌滤纸吸干水分、晾干；
(4)将晾干的卵粒移入到具有无菌组培苗或组培叶片的容器中，用无菌透气封口膜封口，上述操作均在无菌环境中进行；
(5)将步骤(4)的容器放置于人工气候室中，保持气候室内空气洁净，让卵粒孵化生长，从而获得肠道无菌的昆虫幼虫。
9.应用权利要求1-8任一所述的方法制备得到的肠道无菌昆虫幼虫。
10.权利要求9所述的肠道无菌昆虫幼虫在作为昆虫动物模型方面的应用。
技术总结