本发明属于纳米材料的应用领域，具体涉及一种碳点作为抗冻材料的应用。
背景技术：
在材料领域，碳点的应用越来越广泛，碳点是一种尺寸在10nm以下的分散性极好的纳米材料。常用的制备方法主要分为两类，一类是自上而下的制备方法，包括：电解法、酸刻蚀、激光刻蚀等；另一类是自下而上的方法，包括：水热法、化学合成法、微波法等。因为其具有原材料丰富，易制备、分散性好、低毒性、生物相容性好、绿色环保等特点，被越来越多的应用在生物领域和工业领域，具有广泛的应用范围，引起越来越多的科研人员的关注。但尚未见报道其抗冻性能。
技术实现要素：
本发明提供了一种碳点作为抗冻材料的应用。具体来说，所述碳点可以用于抑制冰晶生长。
本发明的碳点具有类石墨结构，存在晶格缺陷，其表面存在亲水基团。
根据本发明的实施方案，所述碳点的晶格尺寸为0.36nm。
根据本发明的实施方案，所述碳点尺寸为1-20nm，例如1-10nm。
根据本发明的实施方案，所述碳点是以葡萄糖为底物制备的。
根据本发明的实施方案，所述碳点是以葡萄糖为底物通过水热法制备的；
根据本发明的实施方案，所述水热法包括：将葡萄糖溶解在水中，形成葡萄糖溶液，搅拌溶解，在160-220℃条件下反应收集得到的产物，纯化，干燥。
根据本发明的实施方方案，所述葡萄糖溶液中葡萄糖的浓度为0.1-0.8m；
根据本发明的实施方案，所述水热法的反应反应时间在1-7h。
本发明还提供本发明的碳点用于制备细胞冷冻保存试剂的应用。
本发明还提供一种冷冻保存细胞的方法，包括：将碳点溶液与细胞混合，低温冷冻保存。
根据本发明的实施方案，所述碳点溶液中碳点的浓度为0.1-200mg/ml，例如为1-100mg/ml，优选为2-50mg/ml，更优选5-20mg/ml。
根据本发明的实施方案，所述碳点溶液为碳点分散于水或者缓冲液中所得到的分散液。
本发明中，所述细胞包括但不限于血细胞、生殖细胞、干细胞等，例如绵羊血细胞、马精子细胞。
本发明进一步提供一种细胞冷冻保存试剂，包括浓度为0.1-200mg/ml的碳点。
根据本发明的实施方案，所述细胞冷冻保存试剂中包括缓冲液，例如pbs缓冲液。
本发明还提供一种抗冻剂，所述抗冻剂包括所述碳点。
本发明还提供所述抗冻剂在抑制冰晶生长或冷冻保存细胞中的应用。
有益效果
本发明的发明人出乎意料的发现本发明的碳点由于其特有的晶格结构以及表面大量的亲水基团，因而具有良好的抑制冰晶生长的效果，本发明所述的碳点作为抗冻材料能够抑制冰重结晶，且在功能上具有仿生抗冻蛋白的特性，这种碳点抗冻材料能够很好的吸附在冰晶的表面，在冰晶表面形成微曲率，借助开尔文效应来进一步抑制冰晶的生长。本发明提供的对细胞进行冷冻保存的方法，能够有效的对细胞进行保存，恢复温度后细胞的恢复率可以达到50-100％。
附图说明
图1为实施例1制备的碳点的透射电镜图；
图2为实施例1制备的碳点的红外光谱图；
图3为实施例1制备的碳点的紫外光谱图；
图4为实施例1制备的碳点的x射线衍射；
图5为a)纯水和b)水分散的碳点的冰晶生长形貌光学图片；
图6为a)ph7.4的pbs缓冲液和b)ph7.4的pbs缓冲液分散的碳点抑制重结晶的光学图片；
图7为ph7.4的pbs缓冲液和ph7.4的pbs缓冲液分散的不同浓度的碳点溶液抑制重结晶平均最大冰晶尺寸结果；
图8实施例3中细胞冷冻保存效果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
(1)制备纳米碳点(g-cds)
将0.8m的葡萄糖溶解在水中，充分搅拌溶解，然后加入到反应釜中，在220℃条件下反应7h，所得产物离心三次，转速12000r/min离心时间5min，再透析，真空干燥。
所得到的碳点的透射电镜图如图1所示，红外光谱图如图2所示，紫外光谱图如图3所示，x射线衍射图如图4所示。
(2)纳米碳点抗冻性能测试
冰晶生长速率测试：不同过冷度(δt)的冰晶形貌变化及冰晶生长是通过纳升渗透压仪器进行观察的，纳升渗透压的温度精确度为0.01℃。纳升渗透压是由低温循环泵、温度控制器组成。一般来说，选取浓度为10mg/ml的水分散的碳点溶液，将碳点溶液注射到含有硅油的温控小孔内。然后将温度降低至-20℃，等碳点溶液结冰后，随后温度上升。当出现单冰晶且其大小能够保持20s不发生变化的时候，此时的温度称为融化温度(tm＝-0.15℃)。然后缓慢的将温度降低到某个特定值(tf＝-0.17℃)，tf-tm我们称为过冷度(δt＝0.02℃)。同一过冷度重复测试三次。通过将冰晶伸长长度除以冰晶生长过程中经过的时间来确定生长速率，并从三个平行实验的视频中计算出平均值。图5提供了a)纯水和b)水分散的碳点的冰晶生长形貌光学图片，其中，a)纯水中的冰晶生长速率为20μm·s-1，b)水分散的碳点的冰晶生长速率为10μm·s-1。
冰重结晶抑制(iri)活性分析：通过“溅射冷冻法”进行测试，将碳点溶解在ph7.4的pbs缓冲液(碳点浓度20mg/ml)中，与碳点溶液应用于细胞冷冻保存时的应用环境保持不变。为了确定iri活性，将1.5m高的10μlpbs分散的碳点溶液液滴滴到放置在linkam低温冷台(lts420)上的盖玻片上，温度先前设定为-60℃，然后在10℃·min-1的加热速率下将温度加热至-6℃进行退火30分钟。随后，用光学显微镜(az100，尼康)拍摄冰重结晶的图像，如图6所示。图6a为不加入碳点的pbs缓冲液的重结晶图像，6b为加入碳点的pbs缓冲液的重结晶图像，加入碳点后冰晶尺寸明显小于不加碳点的pbs缓冲液，可见碳点的加入显著改善了pbs缓冲液体系的抗冻性能，起到了抑制冰晶生长的效果。
利用imagej纳米测量软件测量冰晶的尺寸大小。在每个图像中选择十个最大的单个冰晶，并将该过程重复三遍以获得平均最大晶粒尺寸(mlgs)。mlgs值越小，则表示iri活性越好，结果如图7所示。根据图7可以看出，加入g-cds后，相比于不加g-cds，溶液体系中的平均最大晶粒尺寸显著减小，且在一定范围内随g-cds浓度增加，mlgs越小，在20mg/ml时平均最大晶粒尺寸达到60μm左右。
实施例2pbs缓冲液(ph＝7.4)分散的纳米碳点溶液的制备
将0.8m的葡萄糖溶解在水中，充分搅拌溶解，然后加入到反应釜中，在220℃条件下反应7h，所得产物离心三次，转速12000r/min离心时间5min，再透析，真空干燥。取20mg的碳点加到pbs缓冲液中，浓度为20mg/ml。
实施例3碳点的应用实验
细胞选用的是绵羊血细胞。选取5ml的血细胞，转速4000r/min，离心5min，离心洗涤数次，直到悬浮液澄清。将得到的血细胞保存在4℃冰箱中备用。取50μl预先准备好的血细胞，然后加入同体积的实施例2制备的碳点溶液，碳点浓度为20mg/ml。最终得到含有细胞的碳点浓度为10mg/ml。然后在液氮中保存8h，将冷冻的细胞在45℃水浴温度复温，被破坏的血细胞会暴露出血红蛋白，然后通过紫外测试血红蛋白含量得出细胞恢复率，在图8中可以看出纯的pbs缓冲液冷冻保存细胞恢复率基本上为0％，而pbs缓冲液分散的碳点冷冻保存细胞恢复率基本上为60％，为未来的冷冻保存材料提供了新思路。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种碳点作为抗冻材料的应用，其特征在于，所述碳点可以抑制冰晶生长。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述碳点具有类石墨结构，存在晶格缺陷，其表面存在亲水基团；
优选地，所述碳点尺寸为1-20nm，例如1-10nm；
优选地，所述碳点的晶格尺寸为0.36nm。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述碳点是以葡萄糖为底物制备的。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述碳点是以葡萄糖为底物通过水热法制备的；优选，所述水热法包括：将葡萄糖溶解在水中，形成葡萄糖溶液，搅拌溶解，在160-220℃条件下反应收集得到的产物，纯化，干燥；
优选地，所述葡萄糖溶液中葡萄糖的浓度为0.1-0.8m；
优选地，所述水热法的反应反应时间在1-7h。
5.一种冷冻保存细胞的方法，包括：将碳点溶液与细胞混合，低温冷冻保存。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳点溶液中碳点的浓度为0.1-200mg/ml，例如为1-100mg/ml，优选为2-50mg/ml，更优选5-20mg/ml；
优选地，所述碳点溶液为碳点分散于水或者缓冲液中所得到的分散液；
优选地，所述细胞为血细胞、生殖细胞、干细胞等，例如绵羊血细胞、马精子细胞。
7.碳点用于制备细胞冷冻保存试剂的应用。
8.一种细胞冷冻保存试剂，其特征在于，所述细胞冷冻保存试剂包括浓度为0.1-200mg/ml的碳点；
优选地，所述细胞冷冻保存试剂中包括缓冲液，例如pbs缓冲液。
9.一种抗冻剂，其特征在于，所述抗冻剂包括碳点，所述碳点是以葡萄糖为底物通过水热法制备的；优选，所述水热法包括：将葡萄糖溶解在水中，形成葡萄糖溶液，搅拌溶解，在160-220℃条件下反应收集得到的产物，纯化，干燥；
优选地，所述葡萄糖溶液中葡萄糖的浓度为0.1-0.8m；
优选地，所述水热法的反应时间为1-7h。
10.权利要求9所述抗冻剂在抑制冰晶生长或冷冻保存细胞中的应用。
技术总结