本发明属于细胞冻存技术领域，具体涉及一种nk细胞冻存液。
背景技术：
nk细胞(naturalkillercells)是人体防御肿瘤的第一道防线，在固有免疫系统具有重要的作用，不需要提前致敏就可以对肿瘤细胞进行直接杀伤。虽然现在nk细胞已经被用于肿瘤免疫的细胞治疗，并在临床治疗肿瘤(如白血病，淋巴瘤和黑色素瘤)有很好的效果；但不论对第三方细胞库，还是对配送和应用临床管理来说，nk细胞的长期有效储存始终是一个问题。
低温贮藏技术是通过在超低温(-198℃的液氮中)冷冻保存活细胞，降低细胞的代谢速度，调节和控制细胞生长代谢的各种酶的活性受到抑制，使细胞内在的生化反应十分缓慢，甚至停止生长，从而保持细胞活性延长细胞保存年限。现有的细胞冻存液基本都是由细胞基础培养基(如dmem，rpmi1640等)、胎牛血清(fbs)和二甲基亚砜(dmso)制备的。其中二甲基亚砜dmso(dimethylsulfoxide)的作用是作为冷冻保护剂来保护细胞在冷冻和复苏的过程中免受损伤。dmso属于渗透性保护剂，它能快速渗入细胞内，减少细胞暴露在有害环境的时间。但是dmso在常温下对细胞有毒性作用。即使在复苏的过程中移除了绝大部分，但微量级的剩余也会对人体产生副作用(神经毒性，心血管衰竭，呼吸停止和致命的心率衰竭)。有文献报道，使用dmso冻存的nk细胞在复苏后，其活性和功能性杀伤活力有所退化。此外，胎牛血清fbs会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素。因此，用一种可以替代dmso的冷冻保护剂及胎牛血清的无毒生物相容冷冻保护剂作为nk细胞冻存液就具有重要的意义。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种nk细胞冻存液，从而解决现有细胞冻存液使用dmso和胎牛血清fbs而导致的问题。
本发明的nk细胞冻存液，是不使用dmso和胎牛血清fbs；而是在细胞培养基中添加葡萄聚糖和多聚赖氨酸cpll制成的；
所述的细胞培养基为细胞培养用基础培养基，为rpmi1640、dmem、α-mem、dmem/f12等；
所述的葡萄聚糖在基础培养基中的添加的质量体积比为2～10％；优选为5％；
多聚赖氨酸cpll在基础培养基中的添加的体积比为5～10％；优选为7.5％；
本发明还提供一种冻存nk细胞的方法，使用上述的冻存液来冻存nk细胞，其所冻存的nk细胞的浓度为5×105～1×108cells/ml。
本发明的冻存液不包括动物或人源血清，防止了人畜共患传染病的潜在传播或引起同种异体反应的风险；加入的葡聚糖和cpll不仅能减少冻存和复苏过程中冰晶对细胞的损伤，还能有效的保持细胞杀伤活性，使冻存复苏后细胞的功能状态持平，冻存效果好；本发明冻存液制备简单，安全，可用于临床细胞治疗的冻存，有很好的应用市场。相对于现有生物冷冻保护剂的冻存液，本发明只添加葡萄聚糖，cpll和基础培养基，成分简单，且可以用于nk细胞的冻存。
附图说明
图1：不同冻存液对nk细胞活性影响；
图2：冻存前nk细胞形态图；
图3：外周血nk细胞冻存液冻存1年后复苏后的细胞形态图；
图4：冻存1年复苏后nk细胞生长曲线图；
图5：冻存前后(1年)nk细胞对k562细胞杀伤活性曲线图。
具体实施方式
本发明具体实施例中使用的dmem购自sigma公司，货号为d0819-500ml；葡聚糖购自sigma公司，货号为1179708-50mg，丁二酸酐购自sigma公司，货号为239690-50g，ε-多聚赖氨酸溶液购自akronbiotech公司。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1本发明冻存液冻存nk细胞1年前后细胞活性和形态检测
本发明比较了3种细胞冻存液对复苏后nk细胞活性的影响。这三种冻存液配方如下：10％dmso 20％fbs 70％dmem，5％四氢甲基嘧啶羧酸(ectoine) 10％葡聚糖(dextran) 85％dmem，10％葡聚糖(dextran) 8％cpll 82％dmem。用以上三种细胞冻液存对nk细胞进行冻存，每种冻存液冻存3支，一个月后复苏，并测定nk细胞活性，结果见图1。结果表明葡聚糖和cpll组合可以稳定的保持细胞活力，后续对这个组合的配比进行优化。
本发明实施例用最常用的dmso细胞冻存液作为对照，在复苏后nk细胞活率，扩增能力和杀伤活性方面的进行了比较。
其中多聚赖氨酸cpll的配制步骤：称量13g丁二酸酐倒入100ml质量浓度为0.25g/ml的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；用10mol/l的naoh水溶液调整所述反应液的ph至7.2～7.4，得到丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸及cpll溶液。
nk细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：先配制cpll溶液，然后配制7.5％(v/v)cpll的dmem溶液，最后加入适量比例的葡聚糖混匀即可。
1)通过ficoll方法获取人外周血单个核细胞(pbmc)；
2)通过用丝裂霉素去增殖处理的41bbl-mil21-k562作为滋养细胞刺激pbmc中nk细胞的扩增，起始培养体系pbmc：滋养细胞＝1：1，pbmc培养浓度1.2x106cells/ml，自体血浆浓度为10％，il-2浓度为100u/ml；
3)第四天补加培养基和终浓度为50u/ml的il-2，以后隔天补加培养基和终浓度为50u/ml的il-2；
4)培养至第八天，观察细胞形态，结果如图2，第八天nk比例在75％左右，收集细胞；
5)分别用本发明配制的冻存液冻存5支细胞作为实验组，常规dmso细胞冻存液冻存5支作为对照组，冻存细胞浓度为1x107cells/ml。
6)将上述各种冻存管放入程序降温冻存盒后立即放入-80℃冰箱过夜，然后再将细胞转入液氮冻存。
7)于冻存12个月后复苏3支实验组细胞和3支对照组细胞，具体步骤：将恒温水浴锅加热至37℃，迅速取出上述各组在液氮中冻存的细胞冻存管，转移至水浴锅中恒温水浴，直至完全溶解，再将溶解后的细胞悬液移至加有完全培养基的离心管中洗涤离心；
8)将上述离心后的细胞用完全培养基重悬培养，按1x106cells/ml浓度接种于培养瓶中，全量添加il-2100u/ml细胞生长因子，置于37℃，5％co2的培养箱中培养96h。
9)nk细胞冻存前后的活率检测
将冻存前和复苏后的nk细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞活率，如下表1所示。
表1：nk细胞冻存前后细胞活率
由表1中可以看出，使用本发明中的细胞冻存液冻存外周血来源的nk细胞，即使经过12个月的冻存，复苏后仍具有较高的细胞活率。实验组和对照组复苏后的细胞活率均在80％以上，实验组比对照组平均高了5％，最高能够达到95％以上，和冻存前细胞活率相差不多。结果表明本发明的细胞液冻存液可以长时间维持冻存nk细胞活率。
10)nk细胞冻存前后的形态观察
将冻存前后的各组nk细胞在倒置显微镜下观察细胞形态，形态观测结果如图2-3所示，观测结果表明，实验组复苏后的nk细胞与冻存前的细胞形态冻存前后无明显差异，细胞饱满，透亮光泽，而且有较多的细胞结团，相对对照组，本发明的细胞冻存液对细胞冻存的影响较小。
11)复苏后nk细胞增殖能力检测
将复苏后的细胞继续培养一周，分别在第3，5，7天取样计数和测定nk细胞活力。细胞扩增能力结果如图4，由图可以看出nk细胞在前两天细胞扩增速率有缓慢回升，后4天可以维持比较高的扩增比例。我们通过实验验证复苏后再进行饲养细胞或细胞因子刺激，nk细胞会继续保持高生长速率。
实施例2nk细胞冻存前后对k562细胞杀伤活力检测
将冻存前后的培养后的nk细胞进行杀伤活性的检测，采用乳酸脱氢酶(ldh)法，
以k562细胞为靶细胞，分别检测各组冻存前后的nk细胞，即效应细胞的杀伤活力。
96孔培养板，每孔含一定数量的nk细胞作为效应细胞，另加入一定数量的k562细胞作为靶细胞，靶细胞数为104cells/孔，每种效靶比设3个平行孔按效靶比5:1、10:1、20:1、40:1，总体积200ul(液体为含胎牛血清的rpmi1640培养液)，37℃，co2培养箱4h，每孔加入20ulcellcounting试剂，37℃、co2培养箱2h，然后用ldhcytotoxicitycolorimetricassaykitii(美国，biovision，货号：k313-500)试剂盒进行检测，采用酶标仪检测波长在490nm时的吸光值(a)。
杀伤活力的计算公式为：
nk细胞杀伤活性(％)＝(实验-nk细胞自发-k562自发)/(k562最大-k562自发)×100％。
结果如图5所示，可以看出各组nk细胞对k562细胞的杀伤活随效靶比的增高而增强，实验组的nk细胞复苏后与冻存前细胞杀伤活力无明显差异，实验组复苏后的nk细胞在不同的效靶比时杀伤活力均明显高于对照组复苏的nk细胞，表明本发明冻存液复苏后对nk细胞杀伤活力影响较少。相比常规冻存液，本发明冻存液复苏的细胞具有更高的杀伤功能。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
1.一种nk细胞冻存液，其特征在于，所述的冻存液不使用dmso和胎牛血清fbs；而是在细胞培养基中添加葡萄聚糖和多聚赖氨酸cpll制成的。
2.如权利要求1所述的nk细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞培养基为rpmi1640、dmem、α-mem或dmem/f12等细胞培养用基础培养基。
3.如权利要求1所述的nk细胞冻存液，其特征在于，所述的葡萄聚糖在基础培养基中的添加的质量体积比为2～10％。
4.如权利要求1所述的nk细胞冻存液，其特征在于，所述的葡萄聚糖在基础培养基中的添加的质量体积比为5％。
5.如权利要求1所述的nk细胞冻存液，其特征在于，所述的多聚赖氨酸cpll在基础培养基中的添加的体积比为5～10％。
6.如权利要求1所述的nk细胞冻存液，其特征在于，所述的多聚赖氨酸cpll在基础培养基中的添加的体积比为7.5％。
7.权利要求1-6任一项所述的nk细胞冻存液在冻存nk细胞中的应用。
8.一种nk细胞的冻存方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1-6任一项所述的nk细胞冻存液来冻存nk细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法中nk细胞的浓度为5×105～1×108cells/ml。
技术总结